1.4显微镜的光学和电子器件的发展

   巧妇难为无米之炊，显微镜的发展伴随着光源，荧光标记，透镜，照相机，电子机件，软件，计算机等的综合发展，缺少任何一样，目前的超分辩率显微镜都不可能完成。因此我们在此先简单介绍一下这些相关配套组件的发展，限于篇幅我们只介绍激光与光子检测装置。

   首先我们从激光谈起。1958年美国人查尔斯﹒汤斯和阿瑟﹒肖洛发现了一个有趣的现象：如果用氖光灯照射稀土晶体，晶体会放出一种鲜艳的强光。他们首次提出了“激光原理”，即物质在受到与其分子固有的振荡频率相同的能量激发时，将产生这种不发散的强光--激光，他们因此获得了1964年和1981年的诺贝尔物理奖。1960年美国科学家梅曼发明了产生波长为0.6963微米的红宝石激光器。梅曼用一个高强闪光灯管照射红宝石(红宝石是掺有铬原子的刚玉)，红宝石就会放出一种红光。如果把红包石的表面镀上反光镜，而只留下一个未镀的小孔，这样红光只能从小孔溢出，从而产生一个集中的细光柱，当它集中照射一点时可以使被照表面达到比太阳表面还高的温度。1961年中国长春光机所王之江等研发出第一台国产激光器，但当时命名混乱，比如光量子放大器等，1964年钱学森应《光受激发射情报》杂志编辑的邀请为Laser一词取命，钱学森回复，并帮忙取名激光，后得到了大家的一致认可从而使激光一词广泛使用。

激光在其他领域的应用远早于激光在细胞成像如共聚焦或多光子显微镜上的应用，最早的激光用来进行定位光损伤或微手术。激光在生物学的的应用也得益于荧光染料与荧光蛋白相关技术的发展。激光有极好的时空相干性，因此激光的使用极大的减小了样品照射点的体积，可以长时间的稳定激发样品中的荧光团，保证信号的变化不是由于激光光源强度的变化而来自样品荧光团的变化。激光也可以以脉冲的形式发射(即间歇性发射一簇一簇的光子群)，脉冲发射可以产生能量更高的照射，而高能照射又是双光子或多光子吸收所必须的条件。

   光子的检测手段有很多：光电倍增管、热电探测器，PN光电二极管、PIN光电二极管，雪崩光电二极管（APD）， CCD， sCMOS。光电倍增管（Photomultiplier，简称PMT），是一种对紫外光、可见光和近红外光极其敏感的特殊真空管。它能使进入的微弱光信号增强至原来的108倍，使很弱的光信号能被测量。光电效应1887年由海因里希﹒赫兹发现，光电现象的物理解释由爱因斯坦1905完成，爱因斯坦因此获得了1921年诺贝尔奖。1934年伯纳德﹒扎尔茨贝格第一个做出了可以有电子扩增效应的光电倍增管。热电探测器主要探测红外信号，在显微镜上的应用还很少见。热电现象是说当物质温度低于居里临界点时(Tc)，具有铁电性的物质如钽酸锂会产生与温度和照射光强度相关的电极化，这种电极化可以作为电信号检测，电信号与光强得到藕联从而可以检测光强度。希腊哲学家西奥弗拉斯塔公元前315年就首次描述了电热现象，然而真正的技术应用自20世纪60年代开始兴起。光电探测器对红外波的探测由Putley在1970年证实，对亚毫米红外线的探测由Hadni在1978年证实。光电二极管(photodiode)是由PN结组成的半导体器件，具有单方向导电特性。在电路中它不是作为整流元件，而是把光信号转化成电信号的光电传感器件。1962年霍洛尼亚柯制成世界上第一次光电二极管，并预言未来是光电二极管的天下。1963年霍洛尼亚柯离开通用汽车到伊利诺伊大学电子工程系任教，通过培养学术的方式推广光电二极管,他的学生现在很多都是硅谷的创业家。1963年霍洛尼亚柯又研发出了半导体激光器，现在已过古稀之年的霍洛尼亚柯仍在进行着光计算机的研究。

   1965年，K.M.约翰逊及L.K.安德森等分别报道了在微波频率下仍然具有相当高光电流增益的、均匀击穿的半导体雪崩光电二极管。从此，雪崩光电二极管作为一种新型、高速、灵敏的固态光电探测器渐渐受到重视。雪崩光电二极管是一种半导体光检测器，其原理类似于光电倍增管，又称固态光电倍增管。当一个半导体二极管加上足够高的反向偏压时，在耗尽层内运动的载流子就可能因碰撞电离效应而获得雪崩倍增。载流子的雪崩增益非常高时，二极管进入雪崩击穿状态；在此以前，只要耗尽层中的电场足以引起碰撞电离，则通过耗尽层的载流子就会具有某个平均的雪崩倍增值。与真空光电倍增管相比，雪崩光电二极管具有小型、不需要高压电源等优点，因而更适于实际应用；与一般的半导体光电二极管相比，雪崩光电二极管具有灵敏度高、速度快等优点，特别当系统带宽比较大时，能使系统的探测性能获得大的改善。

感光耦合元件(Charge-coupled Device， CCD)是一种集成电路，上有许多排列整齐的电容，能感应光线，并将光信号转变成数字信号。受外部电路的控制，每个小电容能将其所带的电荷转给它相邻的电容。到达边缘最后一个单元时，电信号传入放大器，转变成电位。如此周着复始，直到整个影像都完成转换，取样并数字化之后存入记忆体。储存的影像可以传送到印表机、储存设备或显示器。CCD是1969年美国贝尔实验室的威拉德·博伊尔和乔治·史密斯所发明。2006年元月，博伊尔和史密斯获电机电子工程师学会颁发的Charles Stark Draper奖章，以表彰他们对CCD发展的贡献,2009年10月两人荣获诺贝尔物理奖。

2000年EMCCD(electron multiplying charge coupled deive)由Andor公司引入成像领域，它是一个能定量的数字照相机，EMCCD非常灵敏可以检测单个光子而保持很高的量子率。不同于传统的CCD，EMCCD即使在高速的数据读出状态下也不受输出放大器读数噪音的影响。EMCCD的低读出噪音是因为在正常的串行寄存器末端加上了电子倍增寄存器，这个寄存器使在任何读出噪音被加到输出倍增器之前将微弱信号括增，因此使读出噪音可以忽略。

sCMOS(scientific complementary metal-oxide-semicon- ductor)照相机于2009年6月首次进入成像领域，相比于CCD它有很多优势。CCD照相机有很高的灵敏度但采样速度较慢，传统的CMOS照相机也有很快的成像速度但只有较窄的动态范围，而sCMOS有极低的噪音，快速的成像速度，宽的动态范围，高量子率，高分辩率，较大的观察视野等优点。sCMOS因其快速成像的特征及EMCCD相似的灵敏度在超分辩率显微镜中已经开始越来越多的受到研究者的青睐。

1.5 显微镜在20世纪后半叶的发展

1957年马文﹒明斯基(Marvin Minsky)提出了一个以白光为光源的激光共聚焦显微镜技术并注册了专利。共聚焦显微镜是一种利用逐点照明和空间针孔去除样品非焦点平面散射光的光学成像手段，相比于传统成像方法共聚焦可以提高光学分辨率和视觉对比度。1978年，托马斯和克里斯托弗·克莱默设计出一套激光扫描程序。该程序采用激光聚焦的方式逐点扫描物体三维表面，并通过类似于扫描电镜的计算机手段生成图像。1980年Wilson将激光引入了共聚焦显微镜，同样使用样品台扫描，但随后发展的光电倍增管(Photo-multiplier tube, PMT)使共聚焦扫瞄可以用电子器件而不是笨重的样品台完，因此共聚焦显微镜在1980年后才成为标准技术。1985年后激光扫描共聚焦显微镜开始广泛应用于固定生物样品的荧光成像，同时绿色荧光蛋白的发现极大地推动了体内荧光成像的发展。共聚焦的轴向分辩率在0.8微米左右，而xy平面的分辩率是轴向(z轴)分辩率的2-3倍。影响横向和轴向分辩率的因素是物镜数值孔径的大小和聚焦小孔的直径，数值孔径大分辩率高，小孔的直径小分辩率高。

双光子吸收的概念在1931年首次由Göpper-Meyer提出，1961年红宝石脉冲激光(约1ms脉冲)发明后双光子技术在实验中得到证实。turnkey脉冲激光器的发明使双光子等非线性成像技术得到广泛应用。双光子显微镜1990年由康奈尔大学Watt W. Webb实验室的Winfried Denk首次制造出来，他将双光子的概念与激光扫描整合在一起。在双光子显微镜中，钛宝石激光器的脉冲宽度约100飞秒，重复周期80MHz。双光子的基本原理就是具有相同能量的两个光子与同一个分子相互作用，就好像这两个分子整合成一个分子但具有这两个光子的能量和，当然前提是这两个光子必须同时到达样品。多光子是双光子及其它多于双光子吸收的所有技术统称。多光子的激发只发生在物镜的焦点上，所以在多光子显微镜不需要用来剔除非焦平面光的小孔，依然可以产生与共聚焦光学断层扫描相同的效果。多光子的另一优势是激光在红外谱范围（700-1000nm），细胞/组织对这个波段的光子吸收低，光子穿透力强，可以用来深层成像。同时，由于长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，双光子显微镜还被广泛的用在活体成像中，用来长时间观察活动细胞和组织。双光子显微镜在观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。但是双光子的分辩率并不比共聚焦更好，因为双光子的长波长会产生一个更大的聚焦点。如果一个样品在激光共聚焦显微镜下不能分辩开，双光子肯定也不行，这一点在此说明因为很多做成像的人想当然的认为双光子的分辩率更高。

共聚焦显微镜是20世纪后20年的主要光学成像手段，共聚焦显微镜对聚焦点的样品激活，然而当我们只对细胞表面的事情感兴趣时，共聚焦激活的背景荧光就显得比较强。丹尼尔﹒阿克塞尔罗德(Daneil Axelrod)1981年设计了可以对细胞表面结构成像的TIRF显微镜，这样我们可以用TIRF对表面结构成像。所谓成也萧何败也萧何，TIRF的局限也是只能研究在表面发生的事情，对于在细胞内部发生的事情却束手无策。我们在研究时总要保持开放的态度，找到解决问题最好的工具，没有一种技术是全能的。在介绍比共聚焦显微镜分辩率更高的显微镜之前，有必要先介绍一下全息摄影的概念, 因为我们下面要介绍的4Pi技术与全息摄影相关。

1977年乔治·卢卡斯在成名作《星球大战》中首次淋漓尽致地运用了全息摄影技术，莱娅（Leia）公主将3D全息信息制定的秘密计划发给叛军同盟。2009年詹姆斯·卡梅隆导演了《阿凡达》，掀起3D电影技术，影片中出现了一个全息沙盘显示系统。从星球大战到阿凡达，全息技术的时代已经来临。全息摄影就是一种记录被摄物体反射（或透射）光波中全部信息（振幅、相位）的照相技术，而物体反射或者透射的光线可以通过记录胶片完全重建，仿佛物体就在那里一样。通过不同的方位和角度观察照片，可以看到被拍摄的物体的不同的角度，因此记录得到的像可以使人产生立体视觉。普通摄影是记录物体面上的光强分布，它不能记录物体反射光的相位信息，因而失去了立体感。

1947年，英国匈牙利裔物理学家丹尼斯·盖伯发明了全息摄影术，他因此获得了1971年的诺贝尔物理学奖。全息摄影的发明是盖伯在英国BTH公司研究增强电子显微镜性能手段时偶然发现，全息摄影由BTH公司在1947年12月申请了专利（专利号GB685286）。这项技术从发明开始就一直应用于电子显微镜中，称为电子全息摄影技术，但是全息光学摄影技术一直到1960年激光发明后才取得实质性的进展。全息摄影可以分为若干类，透射全息摄影通过向全息摄影胶片照射激光，从另一个方向来观察重建的图像；反射全息摄影或称为丹尼苏克全息摄影通过使用白色光源从和观察者相同的方向来照射胶片，通过反射来重建彩色的图像。在全息摄影中以激光作为光源，将光源分为两束，一组经物体散射的光线会照射到记录介质上，第二束被称为参照光的光线直接照射在记录介质上，这样，两束光发生了叠加干涉。产生的光场看起来只是随机图案，但感光底片上各点的感光程度不仅随强度也随两束光的相位关系而变化。所以全息摄影不仅记录了物体上的反光强度，也记录了位相信息。人眼直接去看这种感光的底片，只能看到像指纹一样的干涉条纹，但如果用参照激光去照射它，人眼透过底片就能看到与被拍摄物体完全相同的三维立体像。一张全息摄影图片即使只剩下一小部分，依然可以重现全部景物。全息原理是基于黑洞量子性质提出的一个新的基本原理，关于全息原理的更深入介绍请参考相关教材。

    1971年克里斯托夫﹒克里默和托马斯﹒克里默提出了完美全息摄影的概念，也称为4π全息摄影。克里斯托夫﹒克里默是德国的物理学家，他是海德堡大学和欧洲分子生物学研究所的教授。克里斯托夫﹒克里默发明了几种克服了传统Abbe's分辩率极限理论限制的方法: 4Pi显微镜(1971/1978)，光谱精准距离的定位显微镜(Spectral precision distance microsocpy， 1996年),空间结构照明(spatially structured illumination, SMI， 1997年)。克里斯托夫﹒克里默的空间结构照明显微镜(Verticl-SMI)是世界上最快的纳米光学显微镜，它的二维图像分别率是10nm而三维图像的分辩率是40nm。

   第一个成功设计出4Pi成像系统的是斯特凡﹒W﹒赫尔（Stefan W. Hell），赫尔1994年在实验中证实4Pi成像。赫尔是德国生物物理学家与光学家，1962年12月23日生于罗马尼，1981年进入德国海德堡大学学习物理学，1990年获得海德堡大学科学博士学位，博士论文导师是固体物理学家Siegfried Hunklinger。在赫尔博士毕业的时候，他还没有完成4Pi显微镜的研究工作，但那时他已经没有了奖学金支持，于是赫尔在家里独立完成了4Pi显微镜的研发。哈佛大学的谢晓亮对赫尔曾寄予了很高的评价。4Pi(π)显微镜也是激光扫描荧光显微镜，但它的轴向分辩率更高,轴向分辩率可以从500-700nm到100-150nm，它的球形聚焦点的体积比共聚焦小5-7倍。商品化的4Pi显微镜在2004年问世，迄今为止，效果最好的4Pi显微镜是与受激发射减损显微镜相结合，这种组合可以达到横向50nm的分辩率，并且使聚焦体积减小到只有共聚焦的150-200倍。

   在4Pi显微镜中，激光通过分光镜分成两束分别照射到正对着的两个物镜，两个物镜发来的光在同一个聚焦位点重叠相干。放出的光被两个物镜接收，通过同一个分光镜整合，然后由滤光片反射到探测器。在理想状态下，每个物镜可以采集Ω=2π的立体角，因此如果有两个物镜我们可以采集数据的立体角是4π。然而在实际的实验中，由于物镜的最大孔径角度在140度，相当于1.3π，因此总的立体角是小于4π的。

激发射减损显微镜(Stimulated emission depletion microscopy)是第一个真正获得广泛认可的超分辩率显微镜。激发射减损显微镜由赫尔1994设计提出，在1999年由实验证实。激发射减损显微镜的原理与实验造作，我们将在后面的章节中具体介绍。激发射减损显微镜可以突破远场显微镜的分辩率极限，所谓远场就是指物镜或探针与样品的距离教远，而近场显微镜的分辩率早在1991年就由埃里克﹒贝齐格(Eric Betzig)率先突破了Abbe分辩率的极限。埃里克﹒贝齐格可以在常温下实现超分辩率，而当时的单分子光谱都是在低温下实行的。但近场显微镜在生物学中用处不大，因此有些受挫的埃里克﹒贝齐格放弃了近场显微镜的研究，退出学术界，转而来到他父亲在密西根的工厂工作。

结构照明显微镜(Structured illumination microscopy)成像是通过特殊的显微镜设计和繁琐的软件分析完成。麦茨﹒古斯塔夫松(Mats G.L.Gustafsson)2000年在UCSF(加州大学旧金山分校)做博士后时发明了具有200nm分辩率的结构照明显微镜。古斯塔夫松在瑞典获得了应用物理和电子工程双学位，博士期间古斯塔夫松从事关于量子场理论的研究，然而他认为这个领域太难或许永远没有出头之日。随后古斯塔夫松转到了显微镜方面的研究，古斯塔夫松觉得显微镜是利用物理方法解决生物问题的极好方向。在加州大学旧金山分校戴维﹒阿加德(David agard)实验室从事博士后研究时开始了结构照明显微镜的研究。然而天渡英才，51岁的古斯塔夫松因脑瘤于2011年4月19日去世。

光活化定位显微镜（photo-activativable localization microscopy或PALM），随机光学重构显微镜（STORM，或stochastical optical reconstruction microscopy)和荧光光活化定位显微镜（fluorescence photo-activativable localization microscopy或PALM）是2006年由三个不同的研究组同时发表的以可控荧光分子为基础的超分辩率显微镜。Patterson 2001年发现了光激活荧光分子(photoactivatable GFP, PA-GFP), PA-GFP由紫外光(390-415nm)激发，发射荧光强度比普通GFP高100倍。PALM的发明人埃里克﹒贝齐格(Eric Betzig)经历最为传奇，因为此时的贝齐格退出学术界已到10年之久，但他始终在关注这个领域。贝齐格在2005年听说光控荧光蛋白的思想后，开始了PALM显微镜的设计，当时贝齐格不在任何科研单位任职也没有科研经费，于是他在自己家的客厅了搭建了第一台PALM显微镜。2006年贝齐格获得了霍华德休斯珍利亚农场研究区的研究员资格，重新开始了他的学术生涯。贝齐格于2011年又推出贝塞尔光束照明显微镜(bessel beam illumination microscopy)，贝齐格认为薄片光微镜(light sheet microscopy)虽然可以研究几百个微米的多细胞结构如胚胎等，但薄光仍然很厚，不能用来研究单细胞， 而贝塞尔光束照明显微镜可以对单细胞快速成像。