4.      讨论

  　 腹腔注射不同稀释度的疫苗后，实验数据清楚显示了抗狂犬病毒中和抗体效价的剂量依赖性。多数的试验数据表明，免疫后第14天中和抗体效价达到最大值。无论是攻毒试验还是RFFIT检测血清抗体，该项试验结果是一致的。

我们进一步证明了检测狂犬病疫苗效价的两种方法之间具有很好的相关性。在对照性研究中，小鼠攻毒试验检测的小鼠存活率与血清学检测的平均中和抗体效价之间具有很好的相关性。其中，标准参考疫苗的相关系数0.82，检测疫苗的相关系数0.83。在高可变性的动物试验中，这些统计数据都被认为是有效的。而且，我们已经证明小鼠攻毒试验中不能达到效价最小值的疫苗，在血清学检测中效价也是很低的。这对于狂犬病疫苗的检测上市是非常重要的。

我们的研究也证实了早期关于抗狂犬病毒中和抗体与脑内小鼠攻毒试验之间有很好的相关性的研究。尽管抗体效价不是评估免疫反应的唯一参数，但是它是用来评估免疫保护性的最广泛应用的检测指标以及免疫成功的可靠指标。我们发现免疫小鼠中和抗体效价（数据未显示）与早期的实验数据呈线性关系。我们也观察到有些试验小鼠完全没有产生中和抗体。这表明，在一定数量的实验动物中，有些对疫苗是高反应的，有些是低反应的，偶尔有些是不反应的。为了避免不反应实验动物带来的假阴性实验结果，在血清学检测中每组至少6只试验动物。只有当至少5/6的试验小鼠的中和抗体效价高于对照组实验动物，该疫苗才能够被认为有效。值得注意的是，小鼠攻毒实验检测受到个体免疫反应性的影响。然而，由于在该检测中每个实验动物只有2种可能的结果（死亡或者存活），所以检测结果的变异程度仍然没有血清学检测结果明显。

依据欧洲药典，两种效价检测方法要求采用不同的免疫途径：当小鼠攻毒试验采用腹腔注射时，血清学检测应该采用肌肉或者皮下注射。我们的实验数据表明免疫途径对抗体效价有明显的影响。腹腔注射途径抗体效价最高，肌肉注射途径抗体效价稍低，皮下注射途径抗体效价最低。这些实验结论证实了Wunderli等的研究。Wunderli等曾经证实在小鼠模型中，皮下注射途径是无效的。但是，与Wunderli等研究相反，我们不能推荐肌肉注射途径。依据我们的经验，在小鼠大腿背侧注射100μl 剂量是相当困难的。一些动物实验指南中规定小鼠肌肉注射途径剂量为50μl，以及佐剂疫苗完全禁止肌肉注射，均证实了这种观点。因此，无论是小鼠攻毒试验还是血清学检测，我们常规实施腹腔免疫途径。我们觉得很难理解为什么对这两种检测方法要规定采取不同的注射途径。

RFFIT被认为是一种可靠的重复性好的抗狂犬病毒中和抗体检测方法。RFFIT是目前为WHO、OIE以及欧洲药典推荐的检测方法。为了提高样本的检测量，我们建立了改良的RFFIT操作程序。改良RFFIT用微量滴定板替代细胞培养板。这样检测价格更加便宜，样品量更少。我们已经证实了改良RFFIT与标准RFFIT实验结果一样可靠，这2种方法是等价的。

与小鼠攻毒试验相比，除了更好的重复性之外，血清学检测还具有对实验动物损伤更小，需要的实验动物数量更少的特点。改良RFFIT符合3R理念中精练和减少的标准，3R即动物试验的减少、精练和替代的英文简称。在我们实验室，用血清学检测替代小鼠攻毒试验节省几乎90%试验动物。在欧洲每年生产几百万剂狂犬病疫苗，因此无论是生产商的实验室还是审评机构的实验室可以节省数以万计的试验动物。

总之，我们的实验数据表明血清学检测是灭活狂犬病疫苗效价检测的适宜方法。相反，由于缺乏重复性和精确性，广泛应用的小鼠攻毒试验被很多权威人士批判。然而，这些缺点也在我们的试验数据中反映出来。很多因素（如实验动物健康状况，实验动物饲养环境，以及实验室工作人员的实验技术等）都会对定量动物实验产生很大的影响。由于免疫和攻毒的途径不能反映自然感染状态，NIH试验也被质疑。而且，CVS显著不同于街毒。与用CVS攻毒相比，一些疫苗在用街毒攻毒时效价明显降低。这样，小鼠攻毒试验只能很粗略地反映出一种疫苗对使用对象的保护力。我们同意这样的观点：小鼠攻毒试验从未被科学地评估过，自从疫苗生产严格标准化并且在GMP车间、GLP实验室进行，该方法不再是合格的检测方法。我们支持Weiβer等人的观点，应当用一种简单的方法替代这种检测。尽管有缺陷，NIH在所有备选的试验方法中仍然是金标准，必须据以评判任何其他替代方法。已经提出了几个替代NIH试验的方法。例如，抗原定量试验用于检测狂犬病疫苗效价。然而，一种疫苗的抗原浓度与该疫苗引发保护性免疫反应之间没有直接的相关性。因此这些检测只能是血清学检测有益的补充。此外，有建议用咬肌途径攻毒的小鼠外周攻毒实验方法。即使这种攻毒途径更加接近自然感染途径，NIH试验的大多数缺点在此实验中也仍然存在。已经有人推荐几种血清学检测。这些血清学检测是基于用抗体结合试验、ELISA或者RFFIT检测免疫动物抗狂犬病毒中和抗体。一种比较复杂的抗狂犬病毒中和抗体定量检测的方法是小鼠中和试验（MNT）。然而与RFFIT相比，MNT缺乏精确性和重复性。目前，RFFIT广泛应用于抗狂犬病毒中和抗体效价的检测。然而验证后，改良的ELISA也能够用于抗狂犬病毒中和抗体检测。这种方法比RFFIT省时，而且不需要攻击病毒。

总之，尽管欧洲药典中有关注射途径和实验动物数量(关于无反应实验动物)的检测程序需要改良，但是血清学检测仍然是值得推荐的检测方法。此外还需要标准参考疫苗作对照。

我们应该鼓励监控机构和生产商放弃不精确的、违背伦理道德的小鼠攻毒试验，而代之以血清学方法检测狂犬病疫苗的效价。我们建议将血清学检测作为人用狂犬病疫苗效价检测的备选方法。以长远角度看，小鼠攻毒试验应该被完全取代。

[ Biologicals, 2009, 37: 119-126, 唐　芳译，严家新校 ]

[译文载武汉生物制品研究所内部刊物《疫苗与免疫》2009,4(2)：40-42]