类器官可用的肿瘤球体侵袭分析工具

从肉眼观察到算法量化的成像数字革命

原刊“大橡科技”公众号

在癌症治疗的战场上，转移（Metastasis）往往是导致癌症患者死亡的重要原因。而转移的较早步骤，便是肿瘤细胞突破原发灶，向周围组织发起的“越狱”式侵袭（Invasion）。

为了在实验室里还原这一复杂过程，传统的2D细胞培养已显乏力。3D肿瘤球体（Spheroids）及类器官（Organoids）模型异军突起，因其能高度模拟肿瘤内部的缺氧、酸中毒及复杂的胞外基质（ECM）相互作用，已成为药物筛选和机制研究的重要标准之一。然而，科学家们在观察这些“微肿瘤”时，却长期受困于图像分析的瓶颈：

形态的“变形虫”效应：有的细胞侵袭时边界清晰、形态紧致；有的则像烟花般迅速铺展，导致分析软件难以精准识别。

图像干扰的“迷雾”：荧光背景不均、培养基中的杂质气泡，常让自动化识别出现误判。

量化的“天花板”：许多实验室仍依赖手工测量侵袭半径，这不仅效率低下，且无法反映细胞迁移的真实空间分布。

针对这些痛点，来自捷克马萨里克大学（Masaryk University）的团队开发出一套名为Cell Invasion的自适应双模式算法，通过技术革新，推动肿瘤侵袭分析进入精确量化时代。

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研究亮点

Research Highlights

1. 提出双模式自适应逻辑：针对紧凑型（Compact mode）与解体型（Disintegrating mode）球体分别设计算法，解决了高侵袭性模型在边界消

失后无法界定核心的难题。

2. 抗干扰检测：引入EMax（扩展极大值）变换，捕捉局部对比度特征，即便在背景波动的图像中也能精准识别微小细胞簇。

3. 深层空间量化指标：引入了最短边缘精确距离与单位周长归一化计数，为不同初始大小的样本提供了统一的对比尺度。

4. 全链路开源生态：算法基于Fiji/ImageJ平台开发，显著降低了实验室引入高通量自动化分析的技术门槛。

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研究内容

Research Content

1. 实验设计：构建可靠的研究体系

1.1 多细胞株模型构建

研究采用了HOS（骨肉瘤）、143B（高侵袭性骨肉瘤）、U-251MG（胶质母细胞瘤）以及HT-29 和 HCT-116（结直肠癌）等细胞株。为了形成球体，研究者使用了1%琼脂包被的12孔板，并配合水平旋转摇床（58 rpm），确保了球体形态的高度均一。

1.2 标准化成像与数据采集

成像设备采用了Leica 6000B 50倍宽场显微镜：

焦平面：严谨聚焦于球体的单个赤道面（Equatorial Plane），以确保捕捉到最核心的切面信息。

采集节点：在嵌入胶原蛋白基质瞬间（START）以及后续24 h、48 h、72 h、96 h进行延时拍摄。

1.3 严谨的统计学方法

数据处理追求严谨，使用了OriginPro 2023进行统计分析：

采用Friedman方差分析处理多个配对组，随后进行 Dunn 多重比较。对于多个非配对比较，使用 Kruskal-Wallis 方差分析与Dunn多重比较。

两组间比较采用Wilcoxon符号秩检验（配对数据）和 Mann-Whitney U 检验（非配对数据）。

数据以平均值、中位数线、范围（1.5个四分位距（IQR）、25–75%区间）和离群值表示。至少进行了三次独立实验。

2. 核心技术解析：算法如何精准识别？

2.1 应对复杂形态的双逻辑体系

传统的分析工具往往在面对高度侵袭性细胞时表现欠佳。该研究通过“双模式”设计，赋予了算法极高的灵活性（见图1）。

图1：(A) 允许用户指定分析完整图像集的对话框，包括起始图像。可选择图像分析方法（解体模式、紧凑模式、自动决定）。默认选择仅检测最大紧凑掩膜组件的选项。显示 EMax 动态和预期伪影半径值的字段。(B) 算法的整体示意图。总结了用于掩膜生成的模式，以及决定选择解体或紧凑模式的关键球体形态学特性。

该掩膜根据模型的紧密度将掩膜计算分为两种模式：一种用于解体的球体，另一种用于紧凑的球体。如果适用模式不明确，算法可以自动确定最合适的选项（图 1A；“Method”字段）。通过激活选项“仅保留球体掩膜的最大组件（将明亮但分离的颗粒视为独立）”，可以考虑球体核心随时间的潜在解体。参数“EMax 动态”和“预期伪影半径”（图 1A,B）允许识别掩膜外的细胞。计算完成后，将显示包含结果和其总结的详细表格。

2.2 解决“边界消失”：紧凑模式vs. 解体模式

对于143B这种在侵袭过程中会发生核心解体（Disintegrating）的细胞，算法采用了创新的“锁定掩膜”策略（见图2）。

图2：START 和 24 小时时间间隔的掩膜计算。对于“解体”模式，掩膜是在 START 时间点通过阈值分割荧光球体从背景中生成的。计算掩膜面积（A）。在 24 小时时间间隔，创建相同大小的掩膜（B）。对于“紧凑”模式，在 START 时间（C）和 72 小时间隔（D）都使用阈值分割生成掩膜。掩膜边界（红色）与荧光球体一起在叠加图中可视化（A-D）。

如果球体核心面积在后期时间点与起始时间点相比减少——表明快速解体——则应仅保留最大的紧凑掩膜组件进行进一步分析。这是通过选择“仅保留球体掩膜的最大组件”选项来确保的。如果未选择此选项，则掩膜可能会错误地包含已不再是球体核心部分的分离物体。

2.3 基于EMax转换的抗干扰检测

针对真实实验中常见的背景干扰，算法摒弃了简单的灰度/像素强度分割，引入了更高级的对比度检测机制（见图3）。

图3：在 START 时（A）和 24 小时后（B）检测掩膜外的物体。显示检测到的物体（绿色）与相应的荧光图像的叠加。通过箭头在叠加图像和荧光图像之间进行交互切换，可直接比较。

伪影排除基于物体大小，因为可用图像有时可能包含气泡或背景波动等伪影，其大小超过细胞的大小。这可以通过在 “附加选项” 的相应字段中输入预期的伪影半径（以微米为单位）来实现（图 1A）。所有在掩膜外且能容纳指定半径圆盘的检测到的物体都将被排除在分析之外。伪影的排除不仅会受到 “预期伪影半径” 设置的影响，还会受到适当的 EMax 动态值的选择或感兴趣区域的定义的影响。

2.4 药效筛选实战：Triptolide的效果验证

在评估抗癌药Triptolide对胶质瘤细胞侵袭的抑制作用时，算法展现了其作为精准标尺的威力（见图4，即原文图7）。

图4：预处理雷公藤内酯醇（Triptolide）和 DMSO 处理的对照组的 U-251 MG 细胞来源的球体被嵌入胶原凝胶中。量化了掩膜外的物体数量（总数和每单位掩膜周长的标准化值）、它们的总面积以及球体边界上最近点的平均距离（A-D）。Kruskal-Wallis 方差分析确定的对照组和雷公藤内酯醇诱导样本之间的显著差异用星号表示。其他显著比较用星号括号显示；*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。在对照组和雷公藤内酯醇处理的球体中，START 时和 72 小时后检测到的代表图像（绿色）在掩膜（黑色）外的物体（E），比例尺 500 μm。

结果清晰地揭示了Triptolide对胶质母细胞瘤球体的扩张具有抑制作用：1μM浓度可显著减少掩膜外物体的总数，0.1μM和1μM浓度均能显著降低单位周长的物体数、掩膜外物体总面积，并缩短物体与球体核心的平均迁移距离。这种深度的拓扑学分析，为药物动力学评估提供了比传统“肉眼看图”更科学的数据支撑。

3. 优势与局限性

该算法的主要优势被总结为以下七点：

图像质量更高：该方法使用荧光图像，这比某些其他方法中使用的明场图像更清晰，且受伪影影响更小。

形态兼容性广：掩膜可以针对各种形状的球体进行计算。只要其他生物模型（如肿瘤类器官或类器官）的形态与该文章描述的球体相似，也可以进行评估。

自适应双模式：算法允许同时评估具有清晰边界的球体和在实验过程中失去锐利边界的球体，并能自动选择合适的模式。

自动化与交互性平衡：评估过程高度自动化，减少了个人内和个人间的偏差，但与传统的分析方法相比，它允许用户根据对图像数据的视觉评估轻松调整关键参数（尤其是阈值）。

抗背景干扰能力：即使在背景值不恒定的图像中，该算法也能可靠地检测到掩膜外的对象。

量化维度更细致：由于能够检测单个对象（而非仅计算总面积），研究人员能够评估其详细特征，例如从球体边界迁移出的距离。

形态学二次过滤：通过计算形状描述符（Shape descriptors），可以根据形状对检测到的对象进行进一步过滤（例如剔除杂质）。

此外，原文还在随后的讨论中补充了两点技术优势：

非规则形态的精确测量：相比于从质心测量距离，该方法计算从掩膜边界到迁移细胞的最短精确距离，这在处理不规则、细长或带有突起的球体时结果更准确。

科学的归一化处理：为了使不同大小的球体结果具有可比性，算法通过球体掩膜的周长对外部细胞数量进行归一化。

该方法的缺点：

基于局部最大值识别掩膜外的物体并不等同于精确的物体分割。对于具有多个不同强度最大值的细胞，根据EMax动态参数的不同，该单个细胞可能被识别为多个物体，或者细胞簇可能被识别为单个物体。该算法侧重于检测而非完全分割，因此检测到的最大值可能无法覆盖物体的整个荧光区域。

另一个重要方面是，胶原基质中未添加增殖抑制剂。因此，掩膜外物体的特征差异可能既源于球状体核心细胞的侵袭，也源于其增殖。鉴于此，该研究更适用球状体扩张（spheroid expansion）而非侵袭（invasion）。

4. 科研人员应用指南：如何辅助自己的研究？

如果您计划将该算法引入您的实验室，建议遵循以下流程以获得严谨的数据：

必拍START帧：START帧需在胶原基质包埋并1h固化完成后立即拍摄，这是定义所有侵袭距离的物理原点。

参数调优：针对您的荧光强度设定合理的EMax dynamic，屏蔽背景噪点。

模式避坑：对于高侵袭模型（如143B），务必勾选Disintegrating mode。若误选Compact 模式，算法会因找不到核心边界而报错。

注意局限：当细胞极度密集重叠时，可能会被错误地计为一个大的整体。

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结论与启示

Conclusion And Implications

该研究开发了新的算法，用于分析3D组织模型，例如嵌入细胞外基质中的球体，可用于表征其侵袭潜力和生长。与现有方法相比的优势体现在自动化程度和侵袭相关测量的多样性，而且能够分析边界不清晰的紧凑球体和分解球体。

从肉眼观察到算法量化，这款工具不仅能显著提升分析效率，更让不同实验室、不同操作者之间的数据变得可比、可追溯。

该工具已在GitLab平台的开源，相信随着这类算法的日益进步以及人工智能的快速发展，类器官图像分析会越来越简便，越来越精准。期待我们能与业界同仁共同探索类器官分析的标准化路径，助力类器官技术在药物筛选与精准医疗中释放更大潜力！

原文信息：

Přikryl M, Rousová A, Acimovic I, et al. Cell Invasion Analysis of Tumor Spheroids Using 2D Image Data[J]. ACS Measurement Science Au, 2025. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmeasuresciau.5c00121

Supporting Information链接：

https://pubs.acs.org/doi/suppl/10.1021/acsmeasuresciau.5c00121/suppl_file/tg5c00121_si_001.pdf

脚本下载地址：

https://gitlab.fi.muni.cz/cbia/cellinvasion.