DNA甲基化——这个在不改变基因序列的情况下调控基因表达的化学修饰，已成为生物领域最炙手可热的生物标志物之一。然而，当高通量测序技术绘制出全基因组甲基化图谱后，科研人员还需要验证其中特定目标区段甲基化率的准确性。

一、甲基化检测的缺陷

为了寻找甲基化的基因序列，以全基因组亚硫酸氢盐测序为代表的NGS技术是无可替代的发现工具。它们能一次性扫描数百万个CpG位点，区分出癌症与正常组织之间差异甲基化。

然而，当研究者试图将某个具体位点的甲基化标志物用于临床诊断或研究时，NGS的局限性便暴露无遗。

首先，“相对定量”的模糊性。NGS测得的甲基化水平本质上是计算比对到该位点的测序读长中甲基化读长的比例。这个结果受到文库构建偏好、测序深度、亚硫酸氢盐转化效率不均一等多重因素的影响，是一个充满噪音的“相对值”，难以在不同实验室、不同批次间实现标准化比对。

其次，灵敏度与成本的矛盾。如需检测极低频的甲基化ctDNA，则需要极高的测序深度，这意味着成本呈指数级增长。对于早期癌症筛查所需的超高灵敏度（<0.1%），基于NGS的甲基化检测在经济上难以承受。

最关键的是，临床诊断与药物伴随诊断需要“定量”。医生和药企监管机构需要的不是一个百分比信号，而是一个像血常规数值一样可重复、可比较的绝对度量，用于明确诊断阈值、判断药物适用性和监测动态变化。

正是这道从“相对发现”到“绝对诊断”的鸿沟，催生了数字PCR作为甲基化验证“金标准”的崛起。

二、数字PCR：如何对甲基化分子进行“人口普查”

数字PCR实现甲基化绝对定量的原理，堪称一场精妙的“分子人口普查”。它并非简单地测量整体信号的强弱，而是对每一个DNA分子进行“户籍调查”。

核心流程：

预处理DNA样本首先经过亚硫酸氢盐处理（或者酶法转换）。这一步骤是甲基化检测的基石。经过这一转化，甲基化与否的差异，便成了DNA序列的差异。

分区：打造数万个“单分子PCR反应器”这是ddPCR的灵魂一步。处理后的DNA溶液被物理分割成数万至数百万个纳升级的独立微滴或微孔。通过统计学稀释，绝大多数微滴中只包含0个或1个目标DNA分子。这一分区操作，彻底消除了传统PCR中不同分子间对反应试剂的竞争，也屏蔽了复杂背景的干扰。

检测与计数每个微滴进行独立的终点式PCR扩增。通过检测每个微滴的荧光信号，即可明确该微滴最初包含的序列是否甲基化。

三、无可替代的优势：为何是“金标准”？

数字PCR在目标区段甲基化验证中确立“金标准”地位，源于其解决临床痛点的四大技术优势：

1.绝对定量，无标准曲线；解决了NGS批次间变异大，难以标准化的困难。

2.终点检测不受扩增效率影响，对FFPE等降解样本耐受性极强。

3.超高灵敏度与精准度；NGS达到同等灵敏度成本极高。

4.更高的性价比与效率，NGS成本高、周期长；数据分析复杂，需生物信息学支持。

四、未来展望

尽管优势显著，数字PCR目前仍主要用于已知、有限数量标志物的验证与检测。未来，它与NGS的关系将是深度互补而非取代：

NGS负责在新疾病、新队列中无偏见地发现全新的甲基化标志物图谱。数字PCR负责将NGS发现的最有临床价值的少数关键标志物，转化为经过严格验证、标准化、可应用于百万例临床检测的诊断产品。