纯化分离是生命科学中最基础的技能，经常分离的大分子就是核酸与蛋白。核酸耐酸，耐碱，耐高温，耐有机溶剂，性质稳定，容易放大，也容易工程化，但是蛋白不耐酸碱，不耐高温，也不耐有机溶剂，特别容易变性。如果说核酸分离是技术，容易重现。蛋白分离有点像艺术，很多的know-how书本上没有，或语焉不详，更依赖师门传承。我入行较早，一路走来，蒙各位师友指点，获益颇多。本文就蛋白纯化（准确说是表达）中蒙杨老师指点，在我初入职场时，攻读学位中，乃至在咨询案例时都发挥了十分重要的一个知识点，与各位同行分享。

 第一次见杨老师是在传染病房！那是一个春光明媚的上午，公司王老板带着我到杨老师床前面试（二面）。那时候我才大学毕业半年，在上海的一家生物公司划水了三个月后回到家乡，懂一些基本的词汇。公司拿了一个课题，但是蛋白一直做不出来。杨老师找了中国科学院的老师作了碱基序列优化，也拿不到有活性的蛋白，进度压力之下，他病倒了；没柰何想招一个人接着往下做，在中部的城市，20多年前，公司没什么人可选。杨老师问了我几个问题，我勉强能接上。本科刚毕业的我，懵懵懂懂中，就成了职场中的纯化小白。

 老板是从中国科学院出来的，碰着那些年健字号，药字号大放送的“好”时光，靠着改剂型的秘籍，拿了许多文号。他觉得要上档次，邀请从研究所退休的杨老师来做重组药物开发。原蛋白是细菌发酵产生，老板非要做转基因，把基因扩增后导入大肠杆菌。问题是细菌发酵纯化的蛋白，具有极好的溶栓活性；而重组的蛋白，一点活性也没有。

 我住在实验室，把知道的“技巧”全测试了一遍，甚至还做了变性和复性。复性的蛋白放到纤原蛋白板的时候，居然出现了微微泛白的迹象，我一阵激动。后来把复溶液点上去作为阴性对照的时候，发现也有同样的现象。推测是复溶液中加入了甘油，甘油在板上渗入较慢，会呈现泛白的现象，和溶解纤原蛋白后透明的还是有明显的区别。这结果对初出茅庐的我，真如一瓢冰水浇头。

 杨老师也慢慢康复了，实验室的活我都能干了，这大大解放了杨老师，他有了很多的时间来阅读文献和思考。有一天，杨老师给了我几篇文章，其中一篇发表在《Nature》上的1989年的论文让我有了不同的思路。虽然做的不是这个蛋白，会不会也有类似的情形：我们构建的质粒是不完善的（只是截断的序列，而不是全长）。虽然有了想法，实施却不容易，因为我们实验室连PCR仪器都没有，更不要提各种限制性内切酶了。杨老师跟我讨论了许久，在老板面前支持我提出的方案：在成熟的蛋白(mature protein)前面加入前导肽（pro-sequence）。

 当时有两个同学在上海，一个同学的实验室有PCR仪器，另一个同学实验室应该有一些内切酶。提完细菌的基因组DNA后，我只身前往上海，拜托两位同学把质粒构建好。拿到测序报告后，我带着转化好的细菌回去发酵表达。被负面结果打击了许久的我们，不眠不休，连续作战，终于纯化出一批蛋白，看到平板上透明圈，我觉得那是世界上最漂亮的圆！经历过这段悲喜，我和杨老师也成了忘年之交，保持着多年的友谊。这段经历，也让我有了继续从事生命科学的信心。也让我意识到，自身知识的单薄，想做好研发不是件容易得事情；也成了我几年后洋插队到美国农村，研究蛋白的动力之一。

 我运气不错，洋插队遇到了很好的导师。他除了学术上比较固执外，其他方面都是一个完人。我当时研究的是一个含金属锌离子的水解酶，老师一直让我重复毕业师兄的实验，就是在培养基里加入钴离子，希望得到含钴离子而不是锌离子的蛋白。我很信任导师，不知是该感谢还是埋怨他的耐心，我做了3年，就是得不到含钴离子的蛋白。看着周围的同学一个个博士毕业，奔赴星辰大海，我为自己的将来感到恐慌。长期性的重复实验，经常性的胡思乱想。一天晚上，思绪飘到自己之前的尤里卡时刻，突然想到，也许该看一下现在的蛋白是否也有信号肽呢？

 第二天早晨我迫不及待的冲进办公室，研究了一下该蛋白的测序报告。这个蛋白居然有信号肽（应该有，蛋白就是分泌到细胞质外去水解目的分子，只是我想着尽快晚上老师交代的任务，忘记了仔细看看自己所研究的蛋白）。和上次不一样，这次是克隆了全长的蛋白。我把信号肽切掉后，让蛋白在细胞质内表达，用基础培养基诱导表达，分别加上不同的金属离子（铁钴镍铜锌），然后得到含不同离子的蛋白。每出来一个，老板都在实验室欢呼： unprecedented! 研究生前3年困扰我的问题，现在都迎刃而解，我因此在第4年发表7篇论文（其中JACS4篇）后毕业。国际上有好几个团队都在研究这类蛋白，大家都没有意识到该蛋白在不同地方表达的差异，让我捡了一个漏，真幸运！

  生活还在继续，纯化未曾停歇，受命运之神的引导，把我带向了工业界。这些年研究了近三位数蛋白，经历过不少奇怪的蛋白，也给不少纯化出过方案。有一个核酸酶的蛋白比较难表达，但是我拿到手后，第一时间就发现它是一个分泌蛋白。没有惊讶，没有欣喜，将信号肽换成表达宿主的，加在成熟蛋白的前面，一切就按部就班向前。那一刻，我的思绪飞回到初见杨老师那个明媚的上午。行文至此，不禁想起蒋捷的词。

                            虞美人·听雨

                                蒋捷

少年听雨歌楼上，红烛昏罗帐。壮年听雨客舟中，江阔云低、断雁叫西风。

而今听雨僧庐下，鬓已星星也。悲欢离合总无情，一任阶前、点滴到天明。

  以此纪念进入纯化领域并认识杨老师24周年！