英文原题：Improving Chlorella protein production under heterotrophic high cell density fed-batch cultivation with a two-stage nitrogen nutrient supply strategy

作者：Baofeng Chen, Ren Gong, Zhixian Qiao, Jun Men, Lu Tan, Shilin Tian, Hu Jin*

01 背景介绍 

我国蛋白饲料资源高度依赖进口，开发新型优质蛋白源已成为解决我国饲用蛋白资源短缺的战略需求。微藻来源的单细胞小球藻作为一种重要的新型非粮蛋白资源，其开发利用价值近年来受到学术界和产业界的广泛关注。传统开放式光自养培养模式是目前商业化小球藻的主要生产途径，但这种户外养殖模式受季节和环境条件限制，生产效率较低。利用成熟的工业微生物发酵设备进行异养高密度培养，可显著提升小球藻生物质产能，被认为是一种更为经济和高效的工业化生产模式。然而，异养发酵过程中小球藻胞内蛋白质含量普遍较低，成为制约异养小球藻作为蛋白资源商业化应用的瓶颈。因此，如何实现异养高密度培养下小球藻胞内蛋白质的高效积累成为小球藻蛋白资源商业化利用的关键。

近日，来自中国科学院水生生物研究所金虎高级工程师团队于Green Carbon发表题为“Improving Chlorella protein production under heterotrophic high cell density fed-batch cultivation with a two-stage nitrogen nutrient supply strategy”文章，提出了一种两阶段氮调控提升异养高密度发酵下小球藻蛋白含量和产量的方法，为高品质小球藻蛋白的规模化发酵生产奠定了技术基础。

02 文章简介

不同碳氮比下小球藻生长动力学和蛋白生产特性

文章首先比较了不同碳氮比下小球藻细胞生长和蛋白生产特性，发现高碳氮比下可以获得较高的生物量浓度，但发酵结束的蛋白含量较低。随着补料液中N浓度的提高（补料液中C/N下降），胞内蛋白含量可以逐步提升，但最高生物量浓度却逐渐下降。尽管低碳氮比发酵培养下细胞蛋白含量可维持在较高水平，但最高生物量浓度和蛋白产量均最低（图1）。

图1. 不同碳氮比（C/N）对异养发酵培养下小球藻（a）生物量浓度、（b）葡萄糖补料量、（c）蛋白含量及（d）蛋白产量的影响

两阶段氮调控可有效提升小球藻蛋白含量/产量但同时也会造成NH₄⁺浓度逐渐积累

      基于以上研究发现，文章进一步提出了一种通过两阶段氮调控提高小球藻蛋白含量和产量策略，在培养前期采用最适生长C/N实现细胞的快速高密度生长，待细胞浓度达到较高浓度后转换成高氮浓度补料液进行补料，可使小球藻蛋白含量和产量得到显著提升。但在切换成低碳氮比培养后会造成细胞碳/氮利用失衡和培养基中NH₄⁺浓度逐渐积累，对细胞产生毒性作用，使得高生物量浓度和高蛋白含量难以同时兼顾（图2）。

图2. 恒定最佳碳氮比（C/N=18）与两阶段切换碳氮比（C/N=18→6）培养条件下，（a, b）生物量浓度与葡萄糖投喂量、（c, d）生化成分及（e, f）细胞形态的对比d和e中的垂直虚线表示碳氮比从18切换至6的时间点

外源添加乙酸能够缓解高NH₄⁺胁迫培养下小球藻细胞毒性

进一步研究发现，在毒性NH₄⁺浓度下，外源添加一定浓度乙酸可以使高NH₄⁺胁迫培养下小球藻持续增长。而且，和不添加乙酸相比，添加低浓度乙酸在NH₄⁺胁迫条件下细胞蛋白含量较初始水平能得到较大提升，表明通过合理调控乙酸的添加可实现高NH₄⁺胁迫下细胞生长和蛋白积累的同步提升（图3）。

图3. 乙酸添加对高NH₄⁺胁迫培养下（a）葡萄糖消耗、（b）乙酸消耗、（c）细胞生长、（d）蛋白含量（空白柱表示初始蛋白含量，填充柱表示144小时时蛋白含量）和（e）培养液颜色变化的影响

总结与展望      

两阶段氮调控是提升异养高密度培养下小球藻细胞蛋白含量和产量的有效策略，但同时会造成细胞碳/氮利用失衡和NH₄⁺浓度的积累，对细胞产生毒性作用。初步研究表明外源添加乙酸可以缓解高NH₄⁺胁迫下的细胞毒性，但其作用机制尚不明确。未来需要进一步解析外源添加乙酸缓解高NH₄⁺胁迫下细胞毒性的分子代谢机制，为后续通过代谢工程和发酵工程手段提高小球藻蛋白质产量提供理论指导。

03 作者

金虎 高级工程师

       金虎，中国科学院水生生物研究所藻类与生物制造研究中心高级工程师。长期从事微藻高密度培养技术开发和资源化利用研究。研究重点包括：1）微藻发酵过程优化与控制技术；2）微藻异养培养规模化放大技术；3）微藻蛋白、色素、多不饱和脂肪酸等高附加值产品的高效积累与调控技术。以第一或（共同）通讯作者在Biotechnology Bioengineering、Bioresource Technology、Harmful Algae 等国际期刊发表论文20余篇，撰写英文专著1章，以第一完成人申请国家发明专利9项（授权5项），先后主持完成国家重点研发计划项目子课题、企业委托、开放课题等项目。担任Aquaculture、Archives of Microbiology、Algal Research、Applied Phycology 等多个期刊审稿人。

04 论文信息

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论文信息

Chen B, Gong R, Qiao Z, Men J, Tan L, Tian S, Jin H. Improving Chlorella protein production under heterotrophic high cell density fed-batch cultivation with a two-stage nitrogen nutrient supply strategy[J]. Green Carbon, 2024.

论文网址

https:// doi.org/10.1016/j.greenca.2024.10.002

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供稿：金虎 高级工程师

（中国科学院水生生物研究所）

编辑：Green Carbon 期刊中心

审核：Green Carbon 期刊中心