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一、产品简介:
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体,是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶,产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外,β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业,比传统的漂白法环保,具有广泛的应用价值。
S-β-XYS催化对硝基苯酚-β-D-木糖苷产生对硝基苯酚,对硝基苯酚在400nm处有特征吸收峰,测定400nm光吸收增加速率,可计算S-β-XYS活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 自备 | 4℃保存 | 甲苯 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 | 临用前加入7mL蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂,仍-20℃保存 |
试剂三 | 液体16mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 液体1mL×1支 | 4℃保存 | 10mmol/L标准品母液 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、天平、可调式移液器、30-50目筛、甲苯、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干,过30~50目筛。
2、标准溶液的配制:把10mmol/L(=10000μmol/L)标准品母液用蒸馏水稀释成300、200、100、50、25、12.5μmol/L的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/L) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/L) |
S1 | 10000 | 970 | 30 | 300 |
S2 | 300 | 300 | 600 | 200 |
S3 | 200 | 300 | 300 | 100 |
S4 | 100 | 300 | 300 | 50 |
S5 | 50 | 300 | 300 | 25 |
S6 | 25 | 300 | 300 | 12.5 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至400nm。
② 操作表:
测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |
风干土样(g) | 0.02 | 0.02 | - | - |
试剂一 | 10 | 10 | - | - |
室温振荡混匀15min | 90℃振荡混匀15min | - | ||
试剂二 | 130 | - | - | - |
蒸馏水 | - | 130 | - | - |
试剂三 | 160 | 160 | - | - |
充分混匀,37℃水浴/恒温培养箱1h后,立即沸水浴煮沸5min(盖紧缠封口膜,防止水分散失),流水/冰浴冷却。10000g,25℃离心10min,取上清液。 | ||||
上清液 | 70 | 70 | - | - |
标准溶液 | - | - | 70 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 70 |
试剂四 | 130 | 130 | 130 | 130 |
充分混匀,12000rpm,25℃离心10min,于400nm下读取吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算△A测定=A测定管-A对照管,△A标准=A标准管-A空白管。注:每个样本需做一个自身对照,空白管只需测定1-2次。 |
4、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(µmol/mL)。
2、单位定义:每天每g土样中产生1μmol对-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活单位(U)。
S-β-XYS活力(U/g土样)=x×V÷W÷T×D=0.0072×x÷W×D
T:反应时间,1h=1/24d; V:反应体系总体积,3×10-4L;
W:样本质量,g; D:稀释倍数,未稀释即为1。
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GMT+8, 2024-11-13 06:19
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