启动子是常用调控基因表达强度的重要元件。启动子工程策略在代谢工程与合成生物学领域中应用广泛。然而，已报道的绝大多数的启动子难以在不同宿主中兼容，导致研究过程中针对特定宿主的反复构建与操作费时费力。构建适用于不同工业微生物细胞的跨菌种启动子，对加快基因功能鉴定以及微生物细胞工厂优化具有重要意义。江南大学未来食品中心康振课题组基于对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母的内源启动子序列的高通量筛选、分析和理性设计，构建了系列适用于不同微生物底盘细胞的跨菌种启动子库。相关研究成果以“Engineering Artificial Cross-Species Promoters with Different Transcriptional Strengths”为题在Synthetic and Systems Biotechnology 期刊上发表。

01研究内容简介

启动子是调控基因表达的重要调控元件，是构建生物合成体系以及高效微生物细胞工厂的基础。然而，目前已报道的绝大多数启动子难以在不同宿主中兼容，导致研究过程中针对特定宿主的反复构建与操作费时费力。对此，研究团队基于对大肠杆菌、毕赤酵母等五种不同原、真核微生物细胞的内源启动子序列的高通量筛选、分析和理性设计，以构建适用于不同微生物底盘细胞的跨菌种启动子库，拓展启动子工具箱。

首先，团队依据前期相关Pbs启动子的研究工作，筛选了来自大肠杆菌不同的UP序列，将其对启动子Pbs的强度增强作用进行比较，这些UP序列包括了内源和人工合成的序列。将较优的UP序列进行序列比对后建立了UP突变文库，通过FACS和多孔板对构建的UP文库进行筛选，得到了一系列具有提高启动子强度作用的UP元件。并选择了较优的三条UP序列作为后续的跨菌种启动子构件。

UP序列的筛选

随后，团队进一步考察了Pbs启动子骨架序列的相关特征，依据大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌σ因子识别偏好性，将σ54、σB及σD识别位点整合至Pbs序列当中，设计了新的跨菌种启动子骨架Pst。在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中，该启动子骨架强度较原始序列显著提升。

设计跨菌种启动子骨架

接下来，为提升启动子在酵母中的转录活性，团队首先表征了来自酿酒酵母和毕赤酵母常用启动子的活性强度，并对其上的转录因子结合位点进行分析与选择。结合上述结果，利用序列兼并算法对不同TFBs进行序列组合重排，并检索不同数目TFBs的最优兼并序列，构建了多个人工UAS序列。进一步，表征了这些人工UAS序列对启动子强度的促进作用。

转录因子结合位点筛选

人工UAS序列的设计

之后，研究团队依据上述实验中的结果，将UP元件、跨菌种启动子骨架、人工UAS序列进行组合，得到了系列跨菌种启动子Psh。该系列启动子在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中均具备转录活性。进一步，通过与各菌株常用启动子比较，对跨菌种启动子在不同细胞中的活性强度进行了表征。

跨菌种启动子的设计与表征

相较于已有报道，该系列跨菌种启动子在5种微生物细胞中产生了较好的强度活性，具有便捷底盘细胞筛选过程、减少菌株构建时间和成本、更快速地实现在不同宿主基因调控和代谢途径优化的应用潜力。此外，研究提出的原核和真核启动子关键元件的联合使用代表了一种新的策略，有利于进一步拓展合成生物学跨物种组分工具箱，可能为启动子工程的未来发展提供新的见解和一定的参考价值。

02资助信息

该研究得到了国家重点研发计划（2021YFC2100800）、中央高校基本科研业务费专项资金项目(JUSRP622003)、江南大学轻工技术与工程学科项目(10152130122301801004)的资助。

03文章信息

Engineering artificial cross-species promoters with different transcriptional strengths

Wenjie Zuo, Guobin Yin, Luyao Zhang, Weijiao Zhang, Ruirui Xu, Yang Wang, Jianghua Li, Zhen Kang

Synthetic and Systems Biotechnology是高质量国际开放获取期刊，创刊2016年。期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域。期刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus、CSCD等重要数据库收录。

• 2023 Impact Factor: 4.4; 位于Biotechnology & Applied Microbiology 领域Q1区

• 2023 CiteScore: 6.9

• 位于《2023年中国科学院文献情报中心期刊分区表》生物学大类2区

• 入选2019年中国科技期刊卓越行动计划高起点新刊项目