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一、产品简介:
谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px 或 GPX,EC.1.11.1.9)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。
GSH-Px 催化有机过氧化物氧化 GSH,产生 GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化 NADPH 还原 GSSG,再生 GSH,同时 NADPH 氧化生成 NADP+;NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰,而 NADP+没有;通过测定 340nm 光吸收减少速率来计算 GSH-Px 活性。
二、试剂盒的组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体110mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×2支 | 4℃保存 | 临用前每支加入200μL蒸馏水充分溶解,现配现用。 |
试剂三 | 液体450μL×1支 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入450μL蒸馏水,现配现用。 |
试剂五 | 液体1.1mL×2支 | -20℃保存 | |
工作液的配制:临用前将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四按照17:1:1:1比例充分混匀,现配现用。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔UV板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、超声细胞破碎仪、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL试剂一进行冰浴匀浆,于8000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌、真菌:取500万细胞,加入1mL试剂一,冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后于8000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置于冰上待测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
提取液 | - | 100 |
样本 | 100 | - |
工作液 | 80 | 80 |
试剂五 | 20 | 20 |
迅速混匀并开始计时,记录第30s时340nm处的吸光值,记为A1测定、A1空白,迅速置于37℃培养箱孵育3min后,测定 3min30s 时340nm处的吸光值,记为A2测定、A2空白,计算ΔA =(A1测定-A2测定)-(A1空白-A2空白)。(注:空白管只需测 1-2 次) |
3、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃条件下,每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×109×V2)÷(Cpr×V1)÷T=107.2×△A÷Cpr
2、按组织样本质量计算:
活性单位定义:37℃条件下,每 g 组织每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×109×V2)÷(W×V1÷V)÷T=107.2×△A÷W
3、按细胞数量计算:
活性单位定义:37℃条件下,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活单位(U)。
GPX活性(U/104 cell)=[△A÷ε÷d×V2×109]÷(N×V1÷V)÷T=107.2×△A÷N
4、按液体体积计算
活性单位定义:37℃条件下,每mL液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为 1 个酶活单位(U)。
GPX活性(U/mL)=[△A÷ε÷d×V2×109]÷V1÷T=107.2×△A
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,100µL=0.1mL
V2:反应体系总体积,200 µL=2×10-4L; d:微量石英比色皿光径,1cm;
ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm; T:反应时间,3min;
W:样品质量,g; D:稀释倍数,未稀释即为1;
N:细菌或细胞数量,以万计; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
活性单位定义:37℃条件下,每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×109×V2)÷(Cpr×V1)÷T=214.4×△A÷Cpr
5、按组织样本质量计算:
活性单位定义:37℃条件下,每 g 组织每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×109×V2)÷(W×V1÷V)÷T=214.4×△A÷W
6、按细胞数量计算:
活性单位定义:37℃条件下,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活单位(U)。
GPX活性(U/104 cell)=[△A÷ε÷d×V2×109]÷(N×V1÷V)÷T=214.4×△A÷N
7、按液体体积计算
活性单位定义:37℃条件下,每mL液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为 1 个酶活单位(U)。
GPX活性(U/mL)=[△A÷ε÷d×V2×109]÷V1÷T=214.4×△A
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,100µL=0.1mL;
V2:反应体系总体积,200 µL=2×10-4L; d:96孔UV板光径,0.5cm;
ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;T:反应时间,3min;
W:样品质量,g; D:稀释倍数,未稀释即为1;
N:细菌或细胞数量,以万计; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
1、样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;
2、工作液和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完;
3、若测定ΔA小于0.005,可延长反应时间至10min,计算时相应改变T。
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