一、产品简介：

β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23)又称β-D-半乳糖苷半乳糖基转移酶，简称乳糖酶，专一性作用于β-D-半乳糖苷类化合物的酶，是细胞溶酶体中的水解酶，该酶广泛存在于各种动物、植物及微生物中,特别是哺乳动物肝、肾、脾及小肠等脏器中。  β-GAL 分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成邻-硝基苯酚，后者在 416nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 β-GAL 活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰和蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆，然后16000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞，加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；16000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积（mL)为500~1000:1比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

2、标准溶液的配制：把20μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μmol/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至416nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围：高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定，并将改变后的D和W代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μmol/mL）。

2、按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol邻-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活单位(U)。

β-GAL活性(U/mg prot)=x×V2÷(V1×Cpr)÷T=0.233×x÷Cpr×D

3、按样本质量计算：

单位定义：每g组织每分钟产生1μmol邻-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活单位(U)。

β-GAL活性(U/g质量)=x×V2÷(W×V1÷V)÷T=0.233×x÷W×D

4、按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟产生1μmol邻-硝基苯酚定义为一个酶活性单位(U)。

β-GAL活性(U/10⁴cell)=x×V2÷(N×V1÷V)÷T=0.233×x÷N×D

5、按液体体积计算：

单位定义：每ml液体每分钟产生1μmol邻-硝基苯酚(PNP)定义为一个酶活单位(U)。

β-GAL活性(U/mL)=x×V2÷V1÷T=0.233×x×D

V：加入提取液体积，1mL；            V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL；

V2：反应体系总体积，0.07mL；         T：反应时间，30min；

W：样本质量，g；                     D：样本稀释倍数，未稀释即为1；

N：细胞数量，以万计；                Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。