细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4/6）在细胞周期和癌症发展中发挥关键作用。靶向CDK4/6对乳腺癌有很好的疗效。然而，对CDK4/6抑制剂（CDK4/6i），如帕博西尼（palbociclib）的耐药性仍然是临床面临的巨大挑战。通过高通量组合药物筛选和基因组测序，研究者发现小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）通过O-GlcNAc转移酶（OGT）的O-GlcNAc糖基化修饰作用在耐帕博西尼的乳腺癌症细胞和肿瘤中被激活。机制研究发现，MITF蛋白49位丝氨酸的O-GlcNAc修饰增强了其与输入蛋白（importin）α/β的相互作用，从而促进其向细胞核的易位，在细胞核中抑制帕博西尼诱导的衰老。对MITF或其O-GlcNAc糖基化的抑制使耐药细胞对帕博西尼重新敏感。此外，临床研究证实，在帕博西尼耐药或接受帕博西尼治疗的患者的肿瘤中，MITF被激活。总之，该研究阐明了调节帕博西尼耐药性的机制，有望为CDK4/6i耐药性乳腺癌症患者的治疗提供新的策略。

qHTCS鉴定出MITF抑制剂ML329可克服帕博西尼耐药性

    为了确定克服癌症细胞帕博西尼耐药性的有效治疗策略，研究者连续使用帕博西尼处理细胞，产生了两株帕博西尼耐药性（PR）乳腺癌症细胞（MCF-7 PR和T-47D PR）。使用MCF-7和MCF-7 PR细胞，用MIPE（Mechanism Interquestion Plate）和NPC（NCATS Pharmaceutical Collection）小分子化合物文库进行了两轮qHTCS筛选。从第一轮筛选中，共鉴定出120种化合物，它们有效抑制MCF-7和MCF-7 PR细胞的增殖。为了鉴定在MCF-7 PR细胞中与帕博西尼协同作用的化合物，研究者选择了对MCF-7 PR细胞活性最强的20种化合物与帕博西尼一起进行第二轮筛选（图1a）。在第二次筛选中，一种名为ML329的MITF抑制剂是可以使MCF-7 PR细胞对帕博西尼重新敏感的热门抑制剂之一（图1a）。为了验证ML329与帕博西尼的协同作用，用ML329和帕博西尼组合处理MCF-7 PR和T-47D PR细胞72小时，并使用Combenefit测量和计算细胞活力。值得注意的是，ML329与帕博西尼的联合处理抑制了两种耐药性细胞的生长（图1b）。

    为了测试联合治疗是否影响细胞周期进展，研究者使用Edu掺入测定法检测了耐药细胞的增殖。帕博西尼或ML329单独使用对细胞周期的进展影响甚微或有限，MCF-7 PR细胞的S期细胞数表明了这一点，然而，ML329和帕博西尼的联合治疗显著减少了MCF-7 PR细胞的S期细胞数，这表明联合而非单独的药物治疗会导致细胞周期在S期之前停滞（图1c）。与这些协同作用一致，联合治疗导致耐药细胞的集落形成能力大幅降低（图1d，e），并使耐药MCF-7 PR肿瘤在体内对帕博西尼重新敏感（图1f，g）。总之，这些结果表明，MITF抑制剂ML329能够克服乳腺癌细胞对帕博西尼的耐药性。

图1：qHTCS鉴定出了克服帕博西尼耐药性的MITF抑制剂ML329

抑制MITF通过激活乳腺癌细胞衰老途径克服帕博西尼耐药性

    接下来，研究者研究了MITF如何调节帕博西尼耐药性。鉴于MITF基因转录多种同源异构体，研究者首先确定哪种MITF同源异构体在耐药细胞中富集。使用RT-PCR，发现MITF-A是MCF-7 PR和T-47D PR细胞中普遍存在的高表达同源异构体（下文中将MITF-A称为MITF）。RNA-seq和Western印迹分析均表明，与敏感细胞相比，耐药细胞中的MITF mRNA和蛋白质表达显著增加（图2a，b）。有趣的是，如细胞存活和集落形成测定所示，小发夹RNA（shRNA）对MITF的抑制使两种耐药细胞对帕博西尼重新敏感（图2c）。一致地，与单独用帕博西尼处理相比，通过shRNA清除MITF并同时使用帕博西尼处理会导致磷酸化成视网膜细胞瘤蛋白（Rb蛋白）显著下降，同时导致p21水平升高（图2d），这表明清除MITF并同时使用帕博西尼会导致耐药细胞的细胞周期停滞。与这些体外结果一致的是，通过shRNA抑制MITF可使MCF-7 PR肿瘤在体内对帕博西尼重新敏感（图2e、f）。因此，MITF似乎在调节CDK4/6i耐药性乳腺癌细胞对帕博西尼的耐药性中发挥着重要作用。

图2：抑制MITF可激活乳腺癌细胞的衰老途径克服帕博西尼耐药

    由于MITF的抑制与帕博西尼会增加衰老标志物p21的表达（图2d），研究者假设抑制MITF会通过诱导衰老使PR细胞对帕博西尼重新敏感。事实上，对MITF的抑制导致MCF-7 PR细胞中衰老相关分泌表型（SASP）基因组的显著富集（图2g）。同时，RNA-seq分析表明，在MITF缺失的细胞中，多个SASP基因（CXCL8、IL-6、CDKN1A、IGFBP7、CXCL12、SERPINE1、CCL-2、IGFBP2和MMP-10）的表达被高度诱导（图2h）。通过qPCR分析进一步证实了这些在MITF缺失后上调的基因（图2i）。同样，单独抑制MITF增加了衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性染色的细胞数量；并且siRNA或ML329与帕博西尼联合抑制MITF进一步增强了MCF-7 PR细胞中衰老的细胞数量（图2j，k）。因此，MITF抑制通过激活耐药性乳腺癌细胞的衰老来克服帕博西尼耐药性。

OGT与MITF蛋白相互作用并促进后者核转位

    为了确定MITF如何调节帕博西尼耐药性，研究者首先检测了MITF在敏感细胞和耐药细胞中的亚细胞定位。令人惊讶的是，在敏感细胞中，MITF主要存在于细胞质中，而在耐药细胞中，MITF主要存在于细胞核中（图3a）。

    为了探索MITF在耐药细胞中的细胞质滞留的机制，研究者进行了质谱分析，以鉴定MCF-7 PR细胞中的MITF相关蛋白。值得注意的是，OGT，即O-连接的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）转移酶，在MITF免疫沉淀部分中显著富集（图3b）。免疫共沉淀（Co-IP）分析验证了内源性MITF和OGT之间的相关性，反之亦然（图3c）。一致地，OGT在体外直接对MITF进行O-GlcNAc糖基化修饰（图3d）。鉴于与敏感细胞相比，OGT在耐药细胞中高表达，研究者假设OGT可能通过耐药细胞中的O-GlcNAc糖基化调节MITF活性。事实上，OGT的过表达或敲低分别显著增加或减少了MITF的O-GlcNAc糖基化（图3e，f），并且OGT的抑制不影响MITF蛋白水平，但显著减少了其在MCF-7 PR细胞中的核积累（图3g）。与这些数据一致，OGT缺失或用OGT抑制剂OSMI-1处理显著增加了MITF和14-3-3蛋白之间的相互作用（图3h，i），而这种相互作用在PUGNAc（OGA抑制剂）处理时减少（图3j）。此外，研究者合成了一种含有MITF结合motif（E-box）的寡核苷酸，并用生物素标记它，然后将它与细胞核裂解物混合。结果表明，OGT缺失显著降低了核MITF与E-box DNA寡核苷酸的相互作用（图3k）。因此，OGT缺失也使两种耐药细胞对帕博西尼敏感（图3l，m）。总之，上述结果有力地表明，OGT直接与O-GlcNAc修饰的MITF相互作用，进而阻止其与14-3-3蛋白的相互作用，促进其核转位。

图3：OGT与MITF蛋白互作并促进其核转位

MITF蛋白S49处的O-GlcNAc糖基化是核积累和耐药性所必需的

    为了进一步研究O-GlcNAc糖基化如何调节MITF活性，研究者进行了质谱分析，以确定MITF的特定O-糖基化位点。分析发现，MITF的O-GlcNAc糖基化主要发生在34-56残基的肽段上，S49是最有可能的O-糖基化位点（图4a）。为了排除MITF肽段上O-GlcNAc修饰是由其他Ser/Thr位点而不是S49位点引起的可能性，研究者将S49以及其他潜在的O-GlcNAc糖基化位点从丝氨酸突变为丙氨酸。有趣的是，只有在S49A突变体中，MITF的O-GlcNAc水平在体外和体内都明显降低（图4b，c），这表明S49是MITF的主要O-GlcNAc位点。

图4：MITF蛋白S49的O-GlcNAc糖基化修饰是其核积累所必需的

    接下来，研究者解析了S49位点的O-GlcNAc糖基化如何调节MITF活性。与野生型（WT）的MITF相比，突变体MITF（S49A）表现出O-GlcNAc水平降低，并增加了与14-3-3蛋白的相互作用（图4d）。此外，核分离和IF分析表明，当OGT过表达增强O-GlcNAc糖基化时，WT MITF而不是MITF（S49A）的核定位增加（图4e，f）。与S49A突变体相比，WT MITF主要定位于细胞核内，因此增加了核MITF与E-box DNA的相互作用（图4g）。MCF-7 PR细胞中MITF的缺失降低了MITF靶向基因CCND1、BIRC1和CCNB1的表达，这通过WT MITF的表达而不是S49A突变体的表达来恢复（图4h）。上述结果表明，MITF在S49的O-GlcNAc糖基化在其核定位和转录活性的调节中起着关键作用。

    接下来，研究者研究了S49处的O-GlcNAc糖基化如何调节耐药细胞对帕博西尼的反应。有趣的是，MITF缺失使MCF-7 PR细胞重新对帕博西尼敏感，其通过重建WT MITF而不是S49A突变体来挽救（图4i）。使用异种移植的肿瘤模型，还发现在MITF缺失的MCF-7 PR细胞中重新引入WT MITF而不是S49A突变体恢复了对帕博西尼的耐药性。因此，MITF的S49处的O-GlcNAc糖基化在调节癌症细胞中的帕博西尼耐药性中起着关键作用。

核定位信号中的O-GlcNAc修饰促进MITF与输入蛋白α/β的相互作用

    输入蛋白（importin）是膜相关蛋白，在调节蛋白在胞质溶胶和细胞核之间的转运中起着关键作用。接下来，研究者探讨了O-GlcNAc糖基化如何调节耐药细胞中MITF的核转位。之前的研究表明，输入蛋白α作为货物蛋白上O-GlcNAc修饰的NLSs的读取器发挥作用，从而促进这些货物蛋白的核转位。鉴于MITF-A定位于细胞质中，并具有一个N端1B1b结构域，且其N端1B1b结构域在MITF-M中缺失，研究者预计1B1b结构域可能在调节其细胞定位中发挥关键作用。使用NLS预测程序，发现MITF在其N末端包含两个假定的核定位信号（NLS）区域（图5a）。第一个NLS而不是第二个NLS的缺失阻碍了MITF在MCF-7 PR细胞中的核积累（图5b）。

    由于O-GlcNAc糖基化位点S49定位于第一个NLS内，研究者假设MITF的O-GlcNAc糖基化通过影响其与输入蛋白α/β的相互作用来调节其核转位。为了确定哪种输入蛋白参与了MITF核转位的调节，研究者使用siRNA检测了IF在各种输入蛋白缺失的细胞中的MITF定位。输入蛋白α4、α7和α8的缺失似乎损害了MITF的核定位，这三种输入蛋白的敲低共同导致了MITF核转位的显著减少（图5c），表明输入蛋白α1、α2和α3对MITF核转位至关重要。这些发现促使研究者测试O-GlcNAc糖基化是否通过影响MITF与输入蛋白α/β的结合来调节MITF的核转位。有趣的是，MCF-7 PR细胞中OGT的抑制显著减少了MITF与输入蛋白α4、α7、α8以及输入蛋白β的相互作用（图5d，e）。

    为了进一步研究O-GlcNAc糖基化如何调节MITF和这些输入蛋白之间的相互作用，研究者通过体外O-GlcNAc糖基化测定产生了O-GlcNAc修饰的MITF。如图6所示，通过GST下拉测定，与非O-GlcNAc糖基化的MITF相比，O-GlcNAc糖基化MITF与这些输入蛋白的相互作用增强，表明O-GlcNAc糖基化促进了这些输入蛋白对MITF的NLS的识别。此外，与S49A突变体相比，WT MITF与输入蛋白α4、α7和α8表现出更强的相互作用，并且通过PUGNAc处理增加O-GlcNAc糖基化进一步增强了WT MITF而不是S49A突变株与输入蛋白α4、α7和α8的结合（图5g–i）。上述结果有力地表明，输入蛋白α/β作为一种传感器来识别MITF的O-GlcNAc糖基化NLS并促进其核转位。

图5：核定位信号（NLS）的O-GlcNAc修饰促进MITF与输入蛋白α/β互作和核转位

MITF的O-GlcNAc修饰通过调节衰老信号传导促进帕博西尼耐药性

    为了研究MITF如何调节癌症细胞中的帕博西尼耐药性，研究者在MCF-7和MCF-7 PR细胞中进行了MITF ChIP-seq。结果显示，ChIP-seq在MCF-7 PR细胞的整个基因组中发现了3000多个位于基因间和基因内区域的MITF占据位点（图6a）。相比之下，与敏感细胞相比，MITF在MCF-7PR细胞中表现出相对更高的结合强度（图6b）。从ChIP-seq分析中观察到，与MCF-7细胞相比，MITF在MCF-7 PR细胞中对四种SASP因子SERPINE1、IL-6、CSF1和PTGER2的启动子区表现出更强的亲和力（图6c）。据报道，所有这四个基因都能正向调节个体衰老。研究者假设MITF可能抑制这些基因在耐药细胞中的表达。事实上，ChIP-qPCR表明MITF与这四个基因（TYR基因作为阳性对照）的启动子区域特异性结合（图6d），并且MITF的缺失增加了这些基因的表达（图6e，f）。这些结果表明，MITF直接抑制这些SASP基因的表达，进而通过抑制耐药细胞的衰老而产生耐药性。

图6：MITF的O-GlcNAc糖基化通过调节衰老信号传导促进帕博西尼耐药性

    为了确定MITF的O-GlcNAc糖基化是否调节这些SASP基因的表达，研究者用WT MITF和S49A突变体重建了MITF缺失的细胞，然后进行qPCR分析。在内源性MITF缺失的耐药细胞中，这些SASP基因的转录抑制仅在WT MITF而不是S49A突变体的再表达时恢复（图6g，h）。同样，只有WT MITF的异位表达能够克服由MITF敲低诱导的衰老，如p21表达减少和SA-β-Gal染色所证明的，而在表达S49A突变体的细胞中没有观察到这种作用（图6i，j）。这些数据共同表明，MITF在S49的O-GlcNAc糖基化对其在帕博西尼耐药细胞中调节衰老相关分泌组的活性至关重要。

MITF在帕博西尼作用下被激活，并在帕博西尼耐药的乳腺癌患者的肿瘤中升高

    接下来，研究者进行了临床研究，以调查在接受CDK4/6i治疗或对CDK4/6i产生耐药性的患者中是否出现OGT-MITF通路升高。鉴于MITF水平的增加有助于帕博西尼的耐药性，帕博西尼治疗可能导致MITF表达的增加。事实上，在MCF7细胞中，帕博西尼处理后，MITF mRNA和蛋白质表达水平均增加（图7a）。接下来，采用ER-阳性乳腺癌症患者来源的异种移植（PDX）模型来评估延长帕博西尼治疗的效果。值得注意的是，与未接受该药物的小鼠相比，对携带PDX肿瘤的小鼠给予帕博西尼治疗也导致MITF的表达水平显著增加。因此，体外和体内研究都表明，帕博西尼治疗可以刺激MITF的表达。

 图7：MITF在帕博西尼作用下被激活，并在帕博西尼耐药的乳腺癌患者的肿瘤中升高

    这些数据鼓励研究者测试在接受帕博西尼治疗的患者中MITF是否也被激活。为此，研究者分析了从NeoPalAna临床试验中获得的患者肿瘤的基因表达数据，其中包括雌激素受体阳性乳腺癌患者在接受帕博西尼治疗前后的肿瘤活检数据。与上述临床前研究结果一致，帕博西尼给药后16-20周（手术阶段），帕博西尼治疗显著增加了MITF mRNA的表达（图7b）。同时，与敏感患者相比，帕博西尼耐药患者在C1D15阶段的MITF表达也显著升高（图7c）。

    为了进一步验证MITF水平的增加是否是调节癌症帕博西尼耐药性的关键因素，研究者检测了一组PDX细胞系中MITF的表达，该细胞系由7个帕博西尼敏感性样品和7个帕博西尼耐药性样品组成。值得注意的是，与敏感品系相比，大多数帕博西尼抗性PDX品系中MITF、OGT和O-GlcNAc的表达水平增加（图7e）。乳腺癌类器官组织捕获疾病异质性，因此被广泛用作药物发现和精确肿瘤学的临床模型。研究者从对帕博西尼耐药的PDX WHIM37AR中开发了一种对帕博西尼耐药的类器官。使用该模型，测试了ML329和帕博西尼联合用药的疗效。如图7f所示，在这个帕博西尼耐药的类器官模型中，ML329与帕博西尼发挥了巨大的协同作用。总之，这些来自临床样本的数据有力地证明了MITF在帕博西尼耐药性肿瘤中上调，并且ML329可以在临床模型中克服帕博西尼耐药性。

    鉴于MCF-7 PR细胞和帕博西尼耐药患者的MITF mRNA与敏感患者相比有所增加，而抑制OGT并不影响MITF mRNA水平，研究者接下来研究了MITF mRNA在耐药细胞中的调控方式。在分析了NeoPalAna临床试验的患者数据后，发现接受帕博西尼治疗的患者CREB通路显著增加（图7g）。由于CREB直接调节MITF的转录，研究者认为CREB途径可能调节耐药细胞中MITF mRNA的表达。事实上，CREB途径在帕博西克利布耐药细胞系中富集（图7h，i）。此外，帕博西尼治疗导致p-CREB表达的剂量依赖性增加，并且通过使用其特异性抑制剂666-15抑制CREB通路显著降低了MITF的表达，并使耐药细胞对帕博西尼重新敏感（图7j–l）。因此，基于细胞研究和临床证据表明，CREB-依赖性通路在调控乳腺癌细胞中MITF介导的帕博西尼耐药性中发挥着重要作用。

结论

   研究者发现OGT-MITF通路在调控乳腺癌中的MITF转录活性和赋予对CDK4/6抑制剂的耐药性方面发挥着至关重要的作用。具体而言，OGT介导的MITF在其核定位信号（NLS）内S49位点的O-GlcNAc糖基化具有双重影响：它增强了MITF和输入蛋白α/β之间的相互作用，同时阻碍了其与14-3-3蛋白的结合。这种复杂的相互作用导致了MITF的核定位。在耐药细胞中，增加的MITF通过O-GlcNAc糖基化和CREB依赖性机制抑制衰老，从而导致帕博西尼耐药性。值得注意的是，该研究提供了令人信服的临床证据，证明了MITF对帕博西尼治疗的重要性。这项研究不仅揭示了CDK4/6i耐药性的机制，而且为未来治疗帕博西尼耐药的癌症患者提供了潜在的途径。

Abstract

Cyclin-dependent kinases 4 and 6 (CDK4/6) play a pivotal role in cell cycle and cancer development. Targeting CDK4/6 has demonstrated promising effects against breast cancer. However, resistance to CDK4/6 inhibitors (CDK4/6i), such as palbociclib, remains a substantial challenge in clinical settings. Using high-throughput combinatorial drug screening and genomic sequencing, we find that the microphthalmia-associated transcription factor (MITF) is activated via O-GlcNAcylation by O-GlcNAc transferase (OGT) in palbociclib-resistant breast cancer cells and tumors. Mechanistically, O-GlcNAcylation of MITF at Serine 49 enhances its interaction with importin α/β, thus promoting its translocation to nuclei, where it suppresses palbociclib-induced senescence. Inhibition of MITF or its O-GlcNAcylation re-sensitizes resistant cells to palbociclib. Moreover, clinical studies confirm the activation of MITF in tumors from patients who are palbociclib-resistant or undergoing palbociclib treatment. Collectively, our studies shed light on the mechanism regulating palbociclib resistance and present clinical evidence for developing therapeutic approaches to treat CDK4/6i-resistant breast cancer patients.

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49875-w 

参考文献：Zhang, Y., Zhou, S., Kai, Y. et al. O-GlcNAcylation of MITF regulates its activity and CDK4/6 inhibitor resistance in breast cancer. Nat Commun (2024). 

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49875-w