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一、产品简介:
鞣花酸又名六羟基联苯二酸二内酯,是一种高附加值的林产精细化工品,广泛存在于植物界,可通过鞣花单宁降解以及由没食子酸或没食子酸酯合成。鞣花酸具有较强的抗脂质过氧化和清除自由基的能力,对多种细菌和病毒有抑制作用,能抑制由化学致癌物诱发的肝、肺、食道及皮肤等部位的癌变。
本试剂盒将鞣花酸溶于适量稀碱配制分析试液的方法,确定鞣花酸试样在253nm有最大吸收峰,且试液浓度与吸光度之间具有良好的线性关系。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体80mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前加入100μL试剂一,震荡使其充分溶解后,再加入蒸馏水定容至10mL。(即100μg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板(UV板)、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、30-50目筛、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:将样本烘干至恒重,粉碎,过30-50目筛后,称取0.01g,加入200μL试剂一,80℃水浴提取90min,再加入800μL试剂二混匀,12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。
2、标准溶液的配制:把100μg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μg/mL) |
S1 | 100 | 360 | 240 | 40 |
S2 | 40 | 300 | 300 | 20 |
S3 | 20 | 300 | 300 | 10 |
S4 | 10 | 300 | 300 | 5 |
S5 | 5 | 300 | 300 | 2.5 |
S6 | 2.5 | 300 | 300 | 1.25 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至253nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
上清液 | 200 | - | - |
标准溶液 | - | 200 | - |
蒸馏水 | - | - | 200 |
于253nm处读取吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。 (注:空白管只需测定1-2次) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μg/mL)。
2、鞣花酸含量(mg/g 质量)=x×V÷103÷W×D
V:加入提取液体积,1mL; 103:μg与mg的转换关系;
W:样品质量,g。 D:稀释倍数,未稀释即为1。
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