Cell 封面背后的故事

 -----------脊髓性肌肉萎缩症基础研究与药物开发

       脊髓性肌肉萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是由于正常SMN基因产物缺失造成脊髓前角运动神经元退化，使肌肉逐渐萎缩的一种疾病。患者通常在婴幼儿时期死亡。属常染色体隐性遗传疾病。

  2022年6月9日的Cell 杂志封面绘出一副采用美国雕塑家Alexander Calder风格的动态雕塑，试图展示染色体组蛋白翻译后修饰状态与脊髓性肌肉萎缩症相关基因pre-mRNA中的一个外显子经过剪接后被切除或保留的动态结果。（图1）

为什么会是如此？先从SMN基因的结构谈起。

   脊髓性肌肉萎缩症Spinal muscular atrophy（ SMA types I,II,III)(MIMs 253300, 253550, 253400) Survival motor neuron genes 运动神经元存活基因位于人类第5号染色体上（5q13），在该区域长度大约50万个碱基的片段有四个基因以重复形式存在这四个基因中其中之一就是SMN基因（SMN1黄色，SMN2绿色），与SMN1 基因相比，SMN2基因在外显子7中有一个C突变为T的变异（850CtoT)，导致SMN2在pre-mRNA的剪接过程中外显子7被切除。

SMN2基因的变异位置恰好位于第7外显子内的增强子。

而该处的变异可以抑制与剪接增强子结合从而抑制外显子7保留。

对于正常个体，虽然SMN2的变异导致SMN2基因产物大部分被降解，但SMN1基因产物足以维持生理需要。

    当某些个体SMN1基因发生导致外显子7切除的变异时，该个体就发病。

 那么，究竟哪些变异会影响到外显子7的保留呢？ 这里只举出常用的分析方法。

   右图中可见，含有SE2突变的的小基因检测不到与增强子Htra2-beta1结合的信号，说明该位置与增强子相关。通过如此分析，我们可以对SMN1基因的突变与外显子7保留的关系进行分析，从而推测哪些位置的突变导致疾病的发生。

   那么，是否能通过扰动SMN1 pre-mRNA与相应蛋白因子结合的方法（如位于内含子与剪接增强子作用相反的剪接沉默子与相应蛋白因子结合）来开发治疗这种疾病的药物呢？最简单的方法是寻找能与剪接沉默子相结合的反义寡居核苷酸，使其结合剪接沉默子从而达到竞争性地抑制沉默子与相应行驶沉默作用的蛋白相结合的目的。

2008年Yimin Hua等人做了这样的工作。

这样设计的好处在于简单，避免了引入反式作用因子（蛋白）的技术复杂性。

然而，故事至此并未完结，在2000年之前，人们就观察到剪接与premRNA转录是同时进行的，premRNA的转录有可能通过RNA聚合酶II 的大亚基C末端招募剪接因子影响剪接，或者RNA聚合酶II 的延伸速率会调控premRNA的剪接。后者早在2000年代就已经有不少的实验证据。经典的模型为先到先得模型（first come first serve ）。

于是根据这种模型，可以将延伸的RNApolII看做一辆前进的汽车，其速度至少有两个因素决定:汽车本身的因素和道路因素。对于RNApolII来说，崎岖的道路意味着染色体模板处于可及性差的状态，此时，延伸速率减慢，相应外显子保留概率增加。

据统计，这种RNA聚合酶延伸速率慢，外显子保留增加的选择性剪接事件发生率在50-80%。这类外显子归类为I类（Class I） 外显子。

  然而，在2014年人们发现了另一类型的可变剪接事件与上述不符。

囊性纤维跨膜传导调节蛋白（crystic fibrosis transmembrane conductance regulator ,CFTR）的第8号可变剪接外显子保留水平随RNApolII的眼神速率加快而升高（左）,其解释是由于相应的剪接沉默子来不及与相应蛋白结合，不能发挥抑制外显子9保留的作用，于是外显子9的保留水平增加（右）。

这类可变剪接外显子称为II 类外显子，SMN1基因的第7号染色体属于II类外显子。

   如此说来在用Spinraza治疗的同时加VPA(一种脱乙酰基酶抑制剂，可以使乙酰化水平升高从而使染色体可及性增加。

用VPA提高染色体可及性的方式是全局性的，如果能将局部的染色体可及性提高，这将大大减少副作用。

    采用这种提高局部组蛋白乙酰化水平的方法，的确可以使外显子7保留水平增加。

由此可知，用Spinraza 治疗脊髓性肌肉萎缩症时在竞争性结合位于内含子内的沉默子抑制第7外显子切除的同时又同时提高局部组蛋白H3K9me2的水平，后者又会促使第7外显子的切除增加，处于矛盾状态，只有提高全局或局部的乙酰化水平时，才能提高疗效。

那么Spinraza提高局部组蛋白H3K9me2水平的机制如何?目前尚未知。

总之，目前对ASO（Spinraza）如何引起局部组蛋白H3K9me2水平升高的机制不明。研究仍在继续中。

 附：        

 mouse activity及mouse activity2视频显示在脊髓性肌肉萎缩症小鼠模型治疗中，ASO与VPA联合用药效果

优于单独用ASO治疗

主要参考文献:

Alberto Kornblihtt, (University of Buenos Aires), CSHL Keynote讲座

Anastasia Khvorova, Modulation of DNA transcription: The future of ASO therapeutics? Cell 2022,185:2011-2013

Christian L. Lorson et al A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. PNAS 1999 96(6307-6311)

Gwendal Dujardin et al How slow RNA polymerase II elongation favors alternative exon skipping. Mol Cell. 2014 54:683-690

Luciano E. Marasco et. al.   Counteracting chromatin effects of a splicing-correcting antisense oligonucleotide improves its therapeutic efficacy in spinal muscular atrophy. Cell 2022 185:2057-2070

Malgorzata Ewa Rogalska et.al. Regulation of pre-mRNA splicing:  roles in physiology and disease, and therapeutic prospects. Na. Rev, Genet.  https://doi.org/10.1038/s41576-022-00556-8

Matthew E.R. Butchbach Copy number variations in the survival motor neuron genes:implications for spinal muscular atrophy and other neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Biosciences. 2016 doi:10.3389/fmolb.2016.00007

Matthew E.R. Butchbach Genomic Variability in the Survival Motor Neuron Genes (SMN1 and SMN2): Implications for Spinal Muscular Atrophy Phenotype and Therapeutics Development. Inter.J. Mol. Sci.2021 22:7896 doi.org/10.3390/ijms22157896

Yimin Hua et.al. Antisense Masking of an hnRNP A1/A2 Intronic Splicing Silencer Corrects SMN2 Splicing in Transgenic Mice .AJHG 2008,82:834-848

Yvonne Hofmann et. al. Htra2-b1 stimulates an exonic splicing enhancer and can restore full-length SMN expression to survival motor neuron 2 (SMN2). PNAS 2000,97(17): 9618-9623

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