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一、产品简介:
NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NAO)是一个典型的膜蛋白,催化NADPH氧化生成NADP+,并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。广泛存在于动物、植物和真菌中。该酶异常可导致人慢性肉芽肿病(GCD),在植物中,该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。
NADPH氧化酶(NAO)将NADPH氧化为NADP+的同时生成超氧阴离子(O2 .- ),接着与显色剂反应生成水溶性的黄色物质。对照通过添加该酶的特异性抑制剂DPI排除背景值。最终检测生成的有色物质在450nm处的吸光值,即可计算得出NAO酶活性大小。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体0.25mL×1支 | -20℃保存 | 若凝固可放置室温或25℃水浴溶解。 |
试剂二 | 液体1mL×1支 | -20℃保存 | |
试剂三 | 粉剂×2支 | -20℃保存 | 临用前每支加0.55mL蒸馏水,充分溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,三天内用完。 |
试剂四 | 液体1mL×1支 | -20℃保存 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置于冰上待测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,设定温度37℃,调节波长至450nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20 |
提取液 | 150 | 145 |
试剂一 | - | 5 |
37℃孵育5min(可能会产生沉淀,但不影响后续测定) | ||
试剂二 | 10 | 10 |
试剂三 | 10 | 10 |
试剂四 | 10 | 10 |
37℃避光孵育20min,于450nm读取吸光值A,分别记为A测定、A对照,计算ΔA=A测定-A对照。 |
3、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算:
酶活定义:每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使450nm处吸光值变化0.01为一酶活单位(U)。
NAO(U/mg prot)=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=50×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算:
酶活定义:每克组织每分钟在反应体系中使450nm处吸光值变化0.01为一酶活单位(U)。
NAO(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=50×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算:
酶活定义:每104个细菌或细胞每分钟在反应体系中使450nm处吸光值变化0.01为一酶活单位(U)。
NAO(U /104 cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=50×ΔA÷N
V:加入提取液体积,1mL; V1:加入样本体积,0.02mL;
V2:反应体系总体积,0.2mL; T:反应时间,20min;
W:样本质量,g; N:细胞或细菌总数,以万计;
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
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