摘要  背景和目的：慢性乙型病毒性肝炎患者的肝组织中常进行乙肝病毒抗原的染色，但其与临床表型的相关性尚未很好地描述。方法：通过乙肝研究网络收集大量慢性乙肝病毒感染的成人和儿童的活检标本。用免疫组织化学方法检测乙肝表面抗原（HBsAg）和核心抗原（HBcAg），并由病理委员会进行集中读数，肝损伤的程度。然后将染色模式与包括乙肝临床表型在内的临床特征相关联。结果：共研究了467例受试者的活检组织，其中46例来自儿童。417例（90%）肝细胞表面抗原免疫染色阳性，以散在肝细胞染色为主。HBsAg染色与血清中HBsAg和HBV DNA水平的相关性最好；HBsAg染色缺失往往是血清中HBsAg消失的前奏。HBcAg染色阳性225例（49%），胞浆染色较核染色多见，同一标本常同时见胞核和胞浆阳性。HBcAg染色与病毒血症和肝损伤程度相关。非活动性携带者的活检组织中没有HBcAg染色，而91%的慢性乙肝e抗原阳性的活检组织中HBcAg染色呈阳性。结论：乙肝病毒抗原免疫染色可能有助于了解肝病的发病机制，但对常用的血清学和生化血液检测似乎没有什么帮助。

乙肝病毒抗原的免疫组织化学染色长期以来一直被用来作为评估慢性乙肝病毒感染者肝活检的一部分。¹通过免疫组织化学方法，包括免疫过氧化物酶染色，在肝组织内可以很容易地识别乙肝表面抗原和乙肝核心抗原。²免疫组织化学在慢性乙肝感染患者的临床评估和分类中的作用仍不确定^3-7；导致这种不确定性的一个因素是与肝活检相关的偏差。与活动性肝病患者相比，血清转氨酶水平持续正常的患者接受肝活检的可能性较小。此外，很少有乙肝病毒感染的病例系列包括大量具有相关组织学或免疫组织化学数据的个体。

我们在这里描述了一组慢性乙肝感染者在进行详细的临床、生化和病毒学评估时或在其前后接受肝活检的结果。这些受试者参加了由乙肝研究网络（HBRN）进行的前瞻性研究，其中包括居住在北美的成人和儿童以及来自不同种族和民族背景的人。⁸活组织检查都在一个单一的中央实验室进行，并由一个经验丰富的肝脏病理学家工作组进行共识解释，对临床、生化和病毒学结果视而不见。

患者和方法

患者队列HBRN是由美国国立卫生研究院资助的临床研究网络，致力于研究北美的乙肝病毒感染⁸，由美国和加拿大的11个医疗中心组成，并有一个中央数据协调中心。有乙肝病毒感染的受试者被纳入前瞻性自然病史研究⁹或三项治疗研究中的一项，两名成人和一名儿童。^10-12在这项分研究中，受试者包括如果他们有至少6个月的乙肝表面抗原或乙肝病毒DNA存在的慢性乙肝感染，并有可供审查的肝活检标本。如果受试者在登记时有急性乙肝病毒感染或HIV合并感染，或者如果他们在肝脏活检前4周内接受了抗病毒治疗，则被排除在外。其他排除受试者的原因包括怀孕、肝脏失代偿史、肝细胞癌、实体器官移植史、骨髓移植或慢性免疫抑制治疗的使用。如果病理学家（D.E.K.）认为样本不充分，活组织检查就不包括在这项分析中。或在活检日期后24周内没有相关的临床化验值。

有其他合并肝病的受试者被排除在外，包括血色沉着症或丙型或丁型肝炎。非酒精性脂肪性肝病伴脂肪变性和/或轻度至中度脂肪性肝炎的存在被认为可以被纳入治疗试验，但非酒精性脂肪性肝病伴重度脂肪性肝炎被排除在外，尽管为确定这一点而进行的基线肝活检包括在免疫组织化学染色的分析中。有关纳入和排除标准的进一步细节，请参阅描述队列研究⁹和各种治疗试验结果的出版物（参考文献^10-12）和临床试验网站（NCT01263587、NCT01369212和NCT01263600）。

受试者接受了初步评估，然后作为一系列计划中的前瞻性研究的一部分，定期进行随访，如前所述。肝脏活检不是进入自然病史研究的必要条件，但对于单独使用替诺福韦或替诺福韦和聚乙二醇干扰素α-2a联合使用的免疫活动性慢性乙肝患者的治疗试验来说，肝脏活检是必需的。肝活检是从自然病史研究中登记的其他受试者收集的，这些受试者根据通常的临床实践进行了常规的临床护理。

组织学评估

本研究使用的是每个对象的第一次可用肝活检，其大小和质量都被认为是合适的。如果有一次以上的活检，那么只要在24周内有临床和血清学数据，就使用最早的一次。对于只有一份肝活检标本的受试者，所用的临床数据在活检前后的24周窗口内最接近。

来自肝脏活检组织的未染色切片被送往匹兹堡大学的中心病理实验室进行常规和特殊染色。每个活检的切片分别用苏木素和伊红、马松氏三色染色和免疫过氧化物酶染色检测HBs Ag、HBcAg。活检由HBRN病理委员会集中读取，他们使用Ishak组织活动指数（HAI）系统对包括脂肪变性、坏死性炎症活动和纤维化在内的组织学特征进行一致评分。^13，14次组织学读取以盲法进行。免疫组织化学染色也进行了系统的评估，估计了肝细胞阳性染色的比例和染色模式。HBsAg可呈膜状、包涵体样或颗粒状，可为散在的单个细胞或相邻染色区域。这些模式可以单独出现，也可以组合出现。HBcAg被记录为核质或细胞质，或两者兼有（图1）。肝细胞染色阳性的比例估计为无、<10%、10-50%、50%-90%或>90%，但为了简化分析，将其分为三类：无、<10%或≥10%。

血清生化、血清学和病毒学检测

对乙肝病毒感染的标志物进行血清学检测，如前所述。¹⁵简要地说，使用实时聚合酶链式反应（COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan乙肝病毒检测，v2.0；罗氏分子诊断，新泽西州布兰奇堡）检测乙肝病毒DNA水平。在美国疾病预防控制中心（CDC）病毒性肝炎科分子流行病学和生物信息学实验室用质谱仪¹⁶检测乙肝e抗原（HBeAg）和乙肝表面抗原（HBs）的定量水平。^17、18乙肝病毒DNA的最低检测值为10IU/mL，HBeAg的最低检测值为0.3IU/mL，乙肝表面抗原的最低可定量检测值为0.05IU/mL。如果无法从中心实验室获得数据，则使用当地数据。在当地实验室进行血清生化检测，包括血清转氨酶和胆红素水平。

临床表型

根据HBeAg状态、血清HBV DNA浓度和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平确定临床表型，将患者分为慢性乙肝（HBeAg阳性或阴性）、免疫耐受疾病、非活跃携带者状态或三个不确定类别之一，如先前描述的^19，20（见表1）。简而言之，不确定的A组HBeAg血清阳性，但血清中HBV DNA水平较低。不确定的B表型包括缺乏HBeAg和低水平的HBV DNA，但ALT升高（男性>30U/L，女性>20U/L），而不确定的C组包括HBeAg缺乏，ALT水平正常但HBVDNA中到高浓度的个体。

知情同意

队列研究和三项临床试验的所有细节都得到了每个地点的机构审查委员会的批准，并得到了国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所（NIDDK）选择的中央数据安全和监测委员会的批准，以监测这项研究。所有受试者都给予参与的书面知情同意，包括同意将肝脏活检切片作为常规患者护理的一部分发送出去。到中央储存库。在未成年人的情况下，其父母或法定监护人给予同意，在可能的情况下，也征得儿童的同意。

统计学方法

用非参数方差分析（Kruskal-Wallis检验）比较不同级别的HBsAg或HBcAg染色的连续变量，而分类变量的比较用卡方检验或Fisher精确版本（在细胞频率较小的情况下）。用完全卡方检验比较不同临床表型的HBsAg和HBcAg染色模式和半定量指标。考虑到随访时间的长短，采用泊松比率法计算HBsAg丢失率（在HBeAg阳性受试者中HBeAg丢失率也相同）。根据需要，使用Wald检验或Fisher精确检验在不同组之间比较这些比率。结果以估计率、95%可信区间（CI）和P值表示。使用统计软件包SAS（版本9.4，SAS Institutes，Inc.）进行所有分析。

结  果

在HBRN队列研究或免疫积极治疗试验的2491名参与者中，467人（19%）拥有可用的肝脏活检数据，并被纳入本分析。队列包括421名成人（包括进入治疗研究¹²的194名）和46名儿童（活组织检查时<18岁），他们的人口统计特征如表1所示。大多数患者是亚洲人（81%），而白人（10%）和黑人（9%）是少数。

最常见的临床表型是慢性乙肝（281例，72%），HBeAg阳性（149例，38%）或阴性（132例，34%），主要是因为这些受试者需要接受肝脏活检才能参加免疫活性试验。然而，队列包括一部分免疫耐受的乙肝患者（7.2%）和一些不活跃的携带者（18.5%），这些人通常不会接受活检。不确定表型组较多（82例，21%），其中B类（HBeAg阴性，低HBV DNA，但ALT升高）最常见（65例，17%）。

该组的病毒学特征总结如表2：57%的人HBeAg血清阳性，88%的人有可检测到的HBV DNA水平，范围很广（从<20IU/mL到>1.7×10⁸IU/mL）。在414名受试者中可检出HBV型，最常见的是B型（40%）和C型（36%）。测序显示，病毒变异对病毒复制有相当大的影响，包括33%的G1886A变异位于前核心区，45%的变异位于基本核心启动子的两个常见变异之一。

表3总结了467例肝组织学患者的组织学和免疫组织化学特征。很少有受试者在组织学上有非常严重的肝病。因此，只有6%的人患有肝硬变（Ishak纤维化5或6期），只有4%的人HAI达到或超过¹³（表3）。事实上，大多数患者有轻微的纤维化（57%）或没有纤维化（22%），43%的患者有轻微的坏死炎活动（HAI<5）。

乙肝表面抗原染色

免疫染色显示，90%的活检组织中有HBsAg阳性，最常见的是（52%）至少有10%的肝细胞受到影响。不同比例的乙肝表面抗原阳性细胞患者的临床、生化和病毒学特征如表4所示。肝组织无HBsAg免疫染色的患者年龄较大，血清HBsAg和HBV DNA水平较低。HBsAg染色模式多为混合型。最常见的模式是肝细胞颗粒状胞浆染色（94%），由于这种模式普遍存在，因此没有进一步分析。磨砂玻璃肝细胞典型的包涵体样染色占72%，相邻颗粒染色占61%，膜染色占49%。

尽管HBeAg阳性的慢性乙型肝炎最常见的是膜性染色（70%对37%），而不活跃的HBsAg携带者最常见的是不染色（28%对7%所有其他表型），但HBsAg染色的频率和模式并不能清楚地区分不同的临床表型（表5）。

核心抗原染色

免疫组织化学染色显示49%的活检组织HBcAg阳性。其中，54%的肝细胞HBcAg染色<10%，而HBcAg染色>90%的肝细胞仅占4%。HBcAg染色有两种不同的模式——细胞质染色（78%）和核染色（85%），两者都存在于63%的活检组织中，其中明显的。

HBcAg染色与临床、生化和病毒学的部分关联如表6所示。HBcAg染色与较低的年龄、较高的血清HBV DNA、较高的HBsAg和较高的HBeAg以及较高的ALT水平有显著的相关性（参见表6和图1）。G1896A前C变异体或基本核心启动子变异体的存在与HBcAg染色阳性率较低相关。HBeAg血清阳性与HBcAg高水平染色密切相关（见表6）。这种相关性在所有的HBV型中都是一致的（图1。S1）。HBcAg染色频率和模式与临床表型的关系分析如表7所示。大多数HBeAg阳性的慢性乙肝患者（91%）HBcAg染色阳性，且多见于>10%的肝细胞（51%）。相比之下，在任何非活动性携带者中均未检测到HBcAg染色，在表型不确定的患者（11-29%）和HBeAg阴性的慢性乙肝患者（28%）中很少见到HBcAg染色。在HBeAg阴性的受试者中，10%的≥细胞中检测到HBcAg染色，仅有3%的细胞中检测到HBcAg。有趣的是，在7名“免疫耐受”的乙肝病毒感染者（HBeAg高HBV DNA，但血清转氨酶水平正常）中，只有4人可检测到HBcAg，而且这4人的染色都在10%以上。HBcAg染色与HBV型无关（见图3）。S2）。

免疫组织化学与血清中乙肝表面抗原丢失的关系

在307名在活检时血清HBsAg呈阳性并随后进行了血清HBsAg检测的参与者中，有22人后来从血清中失去了HBsAg（其中15人发生在开始抗病毒治疗后的某个时间点，大多数情况下是在前瞻性随机对照试验¹²的背景下），平均值为3.4活检后数年（0.6~6.3年）。总体计算的乙肝表面抗原丢失率为每100人年1.5人（95%可信区间1.0-2.3）。有趣的是，在肝脏中未检出乙肝表面抗原的人群中，乙肝表面抗原阴转率显著高于检出人群（每百人年5.2[95%可信区间2.3~11.4]vs 1.2[95%可信区间0.7~1.9]，P值0.002）。

血清中乙肝e抗原丢失与免疫组织化学的关系

在139名在肝活检时HBeAg血清阳性并随后进行HBeAg检测的受试者中，72人后来HBeAg消失（其中66人发生在开始抗病毒治疗后的某个时间点，大多数情况下是在前瞻性随机对照试验的背景下^[12]），平均为肝活检后2.1年（范围从0.1到5.3年）。肝内HBcAg阴性组HBeAg阴转率为31.3[95%CI 17.3~56.4]，显著高于HBcAg阴性组的16.1[95%CI 12.5~20.6]（P值0.04）。

免疫组织化学与肝脏脂肪变性的关系

在461例活检标本中，126例发现明显的肝脏脂肪变性（>5%的肝细胞）。在有脂肪变性的患者中，110例（87%）有明显的乙肝表面抗原染色，而在那些没有明显脂肪变性的患者中，有307例（92%）有明显的乙肝表面抗原染色。在有脂肪变性和无脂肪变性的患者中，乙肝表面抗原染色模式没有明显差异。

同样，在有脂肪变性的患者中，53例（42%）有明显的HBcAg染色，而在没有明显脂肪变性的患者中，有174例（52%）有明显的HBcAg染色。在有和没有脂肪变性的患者中，HBcAg染色模式没有发现差异。

肝脏脂肪变性的存在在B表型不确定的受试者中尤其令人感兴趣（其特征是血清中没有HBeAg和低水平的HBVDNA，但ALT值升高）。在82名表型不确定的受试者中，30名（37%）有不同程度的脂肪变性。在65名具有不确定B表型的受试者中，22名（42%）有不同程度的脂肪变性。使用精确检验，在所有不确定的表型中，脂肪变性的存在或不存在在统计学上没有显著差异（P=0.23）。至于B不确定基因携带者中肝脏脂肪变性的程度，高达三分之一的肝细胞中有41%的人有脂肪变性，48%的人在三分之一到三分之二之间，11%的人有超过三分之二的人出现脂肪变性。同样，这些比例与其他不确定表型相比在统计学上没有显著差异（P=0.35）。

讨  论

这一研究队列来自北美，种族和民族多样化，包括成年人和儿童。总体而言，该队列中的肝病相对轻微，但它确实涵盖了疾病活动的范围和阶段，从活跃的肝病到非活跃的携带者，没有纤维化到肝硬化，病毒水平低到高，以及ALT水平正常到显著升高。

这项分析发现，大多数受试者的肝活检组织对HBsAg呈阳性（90%），而仅有约一半的人对HBcAg呈阳性。不活跃的携带者是最不可能染出HBsAg的人群，而那些HBsAg阴性的人更有可能继续从血清中清除HBs Ag。这表明，尽管乙肝表面抗原染色几乎是普遍的，但缺乏染色是一个有利的特征，与非活跃携带者状态相一致，并更有可能从血清中清除乙肝表面抗原。HBcAg染色与病毒血症程度有很好的相关性，最高程度的染色主要见于循环病毒血症水平较高的患者--例如，HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者几乎都有肝脏HBcAg染色阳性。在非活动携带者中，所有（按定义）血清中HBV DNA含量均<1000IU/m L，无一例在肝脏中检测到HBcAg染色

有趣的是，HBcAg染色与血清ALT水平呈正相关，而HBsAg染色与血清ALT水平无关。这种差异支持这样一种假设，即慢性乙型肝炎的肝损伤是由针对表达HBcAg^21、22的肝细胞的细胞毒性T细胞损伤所介导的，并支持这样的发现，即HBs Ag染色与HAI或纤维化评估的肝损伤缺乏相关性，但HBcAg染色与HAI与纤维化之间存在正相关（尽管较弱）。当存在影响基因组前核心区或基本核心启动子的病毒变异时，与肝内HBcAg表达程度较低相关，这与目前的观点一致，即这些变异复制效率较低，通常与较低水平的病毒血症有关。

除了病毒抗原染色的存在或不存在外，还对这种表达模式进行了检查，虽然在这个庞大而多样化的队列中发现了一些粗略的相关性，但发现了足够的可变性，从而否定了关于各种染色模式重要性的一些普遍假设。例如，Chu和Liaw²³发现，肝细胞上HBsAg的膜性染色与血清HBV DNA水平相关，可以被认为是活跃的HBV复制的标志。也有人认为，乙型肝炎表面抗原的膜染色可能与细胞表面循环的病毒粒子结合有关，而不是与感染细胞细胞膜上病毒蛋白的表达有关。然而，在这一队列中，约有一半的HBs Ag阳性病例出现了膜染色，尽管这种染色模式与HBeAg的存在有关，但在使用血清标志物的病毒复制水平较低的病例中，也有相当大比例的病例注意到了这一点（见表3和表4）。在不活跃的携带者中，包涵体类型的染色或多或少相当于磨砂玻璃肝细胞的频率最低。磨玻璃肝细胞代表慢性乙肝病毒感染的组织学标志，在内质网含有表面抗原，²⁴对HBsAg呈阳性染色，呈包涵体样图案，有人认为这可能反映了前S1突变和内质网内积累的HBs抗原，从而使磨玻璃状肝细胞出现。²⁴然而，本研究对象的HBV Pre-S序列尚未得到评估。

在这个队列中，一些病毒和宿主因素被发现与乙肝表面抗原或HBcAg的染色模式无关。因此，HBV型似乎不能预测Kleiner等人不同的乙肝病毒抗原表达模式。肝脏活检发现的脂肪变性可能被认为影响或损害了解释病毒抗原的免疫组织化学染色的能力，但事实并非如此。虽然病毒变异体（突变体）可能通过病毒复制效率和病毒血症水平间接与较低水平的HBcAg染色相关，但未发现这种关联与HBs Ag染色有关。

摘要和结论

在这项大型研究中，大多数慢性乙肝病毒感染者的乙肝表面抗原免疫染色均为阳性。它的存在和染色程度与较高的血清HBsAg和HBV DNA水平有关，但与疾病活动性无关。在不活跃的乙肝表面抗原携带者中，缺乏乙肝表面抗原染色是最常见的，这与随后从血清中丢失更高的乙肝表面抗原有关。相反，尽管HBcAg染色的频率低于HBsAg，但它的存在与更高水平的病毒血症和更严重的肝脏损伤程度密切相关。无活动性的HBsAg携带者肝脏HBcAg染色均为阳性，而HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者几乎全部HBcAg染色均为阳性。

我们的结论是，虽然对乙肝病毒抗原的免疫染色可以深入了解肝病的发病机制，但它似乎不能提供通过较少侵入性的血清生化、血清学和病毒学测试无法获得的额外临床信息。

附原文来源：

David E Kleiner, Mauricio Lisker-Melman, Abdus S Wahed‡, Atul K Bhan, Michael A Nalesnik, Eun-Young K Choi, Kelsey K Leonard, Marc G Ghany,Raymond T Chung, Adrian M Di Bisceglie. Immunostaining for hepatitis B viral antigens in liver:Association with clinical, biochemical, and virologic features of disease David E Kleiner. J Gastroenterol Hepatol. 2023，38(6): 989–998. doi:10.1111/jgh.16167.