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一、产品简介:
苯丙氨酸解氨酶(Phenylalnine ammonialyase,PAL)广泛存在于各种植物和少数微生物中,是植物体内苯丙烷类代谢的关键酶,与一些重要的次生物质如木质素、异黄酮类植保素、黄酮类色素等合成密切相关,在植物正常生长发育和抵御病菌侵害过程中起重要作用。
PAL催化L-苯丙氨酸裂解为反式肉桂酸和氨,反式肉桂酸在290nm处有最大吸收值,通过测定吸光值升高速率计算PAL活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加5mL蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂 4℃保存。 |
试剂三 | 液体1mL×1支 | 4℃保存 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板(UV板)、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至290nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
样本 | 5 | - |
试剂一 | 145 | 150 |
试剂二 | 40 | 40 |
混匀,30℃准确反应30min。 | ||
试剂三 | 10 | 10 |
混匀,静置10min后,测定290nm处的吸光值A,记为A测定和A空白,计算ΔA=A测定-A空白。(注:空白管只需做1-2次。) |
3、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
活性单位定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟使290nm下吸光值变化0.1定义为一个酶活单位(U)。
PAL活性(U/mg prot)=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.1÷T=13.33×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算:
活性单位定义:每g组织在每mL反应体系中每分钟使290nm下吸光值变化0.1定义为一个酶活单位(U)。
PAL活性(U/g质量) =ΔA×V2÷(V1÷V×W)÷0.1÷T=13.33×ΔA÷W
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.005mL;
V2:反应体系总体积,0.2mL; T:反应时间,30min;
W:样品质量,g; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按组织蛋白浓度计算:
活性单位定义:每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟使290nm下吸光值变化0.05定义为一个酶活单位(U)。
PAL活性(U/mg prot)=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.05÷T=26.67×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算:
活性单位定义:每g组织在每mL反应体系中每分钟使290nm下吸光值变化0.05定义为一个酶活单位(U)。
PAL活性(U/g质量) =ΔA×V2÷(V1÷V×W)÷0.05÷T=26.67×ΔA÷W
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.005mL;
V2:反应体系总体积,0.2mL; T:反应时间,30min;
W:样品质量,g; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
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