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一、产品简介:
SOD(EC 1.15.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化超氧化物阴离子发生岐化作用,生成H2O2和O2。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶,也是H2O2主要生成酶,在生物抗氧化系统中具有重要作用。
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-),O2-可与WST-8反应产生水溶性染料甲臜,后者在450nm处有吸收;SOD可清除O2-,从而抑制了甲臜的形成;反应液黄色越深,说明SOD活性愈低,反之活性越高。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体12μL×1支 | -20℃保存 | 使用前按照试剂二:蒸馏水=12:1188的体积比配制(配制前先离心收集再吹打混匀后使用,现用现配) |
试剂三 | 液体2mL×1支 | 4℃避光保存 | |
试剂四 | 液体2mL×1支 | 4℃避光保存 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置于冰上待测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至450nm。
② 测定前将试剂一、三和四37℃水浴5min以上,试剂二使用时在冰上放置。
③ 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 空白管1 | 空白管2 |
样本 | 20 | 20 | - | - |
蒸馏水 | - | 20 | 20 | 40 |
试剂一 | 120 | 120 | 120 | 120 |
试剂二 | 20 | - | 20 | - |
试剂三 | 20 | 20 | 20 | 20 |
试剂四 | 20 | 20 | 20 | 20 |
混匀后,37℃,准确反应30min,冷却至室温后测定450nm处的吸光值A,分别记为A测定、A对照、A空白1、A空白2。计算ΔA测定=A测定-A对照,∆A空白=A空白1-A空白2。(注:每个样本需做一个自身对照,空白管1和空白2各只需测定1-2次。) |
3、正式实验:
① 预实验测定时尽量使样本的抑制百分率在30-70%范围内,越靠近50%越准确。如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%,则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高,则需适当稀释样本;如果测定出来的抑制百分率偏低,则需重新准备浓度比较高的待测样本或者提高加样表中的样本量,但需相应减少测定管和对照管中试剂一的体积;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、抑制百分率的计算:抑制百分率=(ΔA空白-ΔA测定)÷ΔA空白×100%
2、活性单位定义:在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时,反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U)。
3、按样本质量计算:
SOD活性(U/g质量)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V2]÷(W×V1÷V)×D
=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W×D
4、按样本蛋白浓度计算:
SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V2]÷(V1×Cpr)×D
=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×D
5、按细菌或细胞数量计算:
SOD活性(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V2]÷(N×V1÷V)×D
=10×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷N×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.02mL;
V2:反应体系总体积,0.2mL; D:稀释倍数,未稀释即为1;
W:样品质量,g; N:细胞数量,以万计;
Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
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