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论文赏析:
早期肝癌的血液检测:甲基化与蛋白标志物联检法(HepaClear)
本研究的目的是通过血液样本的甲基化qMSP和蛋白标志物联检早期发现肝细胞癌。研究包括四大部分内容:
内容 | 样本 | 方法要点 | 结果 |
靶点发现 | 60对组织样本(肝细胞癌和非癌对照) | 用850k甲基化芯片测试——甲基化水平(β值)——甲基化数据分析(使用 R 包IMA进行)—— |Δβ|> 0.1且p值 < 0.05——差异显著性CpG位点——候选靶标 | 找到10个CpG位点(DMP) |
qPCR检测体系建立 | 60对组织样本(肝细胞癌和非癌对照)——150个血液样本 | 针对10个候选CpG位点靶标,用组织样本建立qPCR检测方法——用150个血液样本对qPCR检测方法进行验证 | 筛选出6个CpG 甲基化位点 |
建模与靶点组合筛选 | 150个血液样本 | qPCR甲基化数据+蛋白检测数据和金标准检测数据——逻辑回归模型——ROC分析——阳性判断值分析——最佳模型(3个CpG 甲基化位点+2个蛋白标志物) | 建立检测模型 |
最佳模型的评价 | 296个血液样本(训练集)和198个样本(验证集) | 用296个血液样本收集数据(qPCR甲基化数据+蛋白检测数据和金标准检测数据)——ROC分析——用198个血液样本收集数据(qPCR甲基化数据+蛋白检测数据和金标准检测数据)————ROC分析——肝癌早筛试剂HepaClear | HepaClear训练集与验证集结果一致,灵敏度高,可用于肝癌早筛 |
研究流程图
结果
最佳标记物组合HepaClear :包含 3 个高甲基化 CpG 位点(cg14263942、cg12701184 和 cg14570307)和 2 个蛋白质标记物(AFP 和 DCP)。
150个血液样本的标记物评分由以下逻辑回归方程得出:Score = 30.9062 − 0.3385 × cg14263942 − 0.2114 × cg12701184 − 0.2202 × cg14570307 + 0.3362 × log2AFP + 0.2656 × log2DCP.
cg14263942、cg12701184和cg14570307是3个甲基化位点的甲基化水平变量(ΔCt);AFP和DCP是蛋白标记的表达水平变量
将样本的标记物得分(Score) 与临床病理检查的金标准结果相结合进行ROC曲线分析,得到以下结果:
HepaClear-PCR检测体系的测试结果如下:
试验 | 血浆样本数 | 灵敏度 | 特异性 |
训练集测试结果 | 296 个 | 82.6% | 96.2% |
验证集测试结果 | 198个 | 84.7% | 92.0% |
图表欣赏
图1A、火山图:本研究采取850k芯片在60对组织样本中探测到不同CpG位点及其甲基化水平数据,按照肝癌与对照的甲基化水平差异情况绘制出火山图。火山图的横坐标是∆β值,即肝癌与非肝癌组织样本的甲基化水平之差值;纵坐标是∆β值t测验得到的显著性概率p值的对数(该值越大表示肝癌与对照的甲基化水平差异越显著)。图中的n代表CpG位点数,图中的每一个坐标点代表一个CpG位点。绿色部分是肿瘤与非肿瘤的∆β值小于0.1的CpG位点,蓝色部分是肿瘤低甲基化的CpG位点(n=216246),红色是高甲基化位点(n=31837个)(可见低甲基化位点在数量上大大多于高甲基化位点)。理想的CpG位点是分布在右上方的红色CpG位点,表现为肝癌与非肝癌甲基化水平差异大,而且p值对数高。
图1B、尽管差异CpG位点有很多,很多位点具有相关性,它们可以通过主成分分析简化为几个不相关的主成分。头两个主成分对总变异的贡献率分别为88.5%和4.2%,累计贡献率达到92.7%,可以将60对肿瘤样本与对照样本较好地分开。
图1C、该热图中的颜色与甲基化β值相对应。行代表不同的 CpG 位点,列代表不同的组织样本。热图来自前 1000 个甲基化 CpG 位点的无监督层次聚类分析。
*火山图、主成分分析图、热图的制作见https://ibook.antpedia.com/x/864460.html
图2A、60 对组织样本(HCC 和正常对照)的qMSP测试结果:10 个候选CpG 位点的甲基化水平(ΔCt = Ctreference - Cttarget)。y轴代表甲基化水平(ΔCt),ΔCt越小代表甲基化水平越高。****表示p < 0.0001。
图2B、150个血浆样本的qMSP测试结果:获得8个CpG标志物的甲基化水平,分别进行单个CpG标志物的ROC分析得到各自的曲线下面积 (AUC)。AUC > 0.8 和 < 0.8 的标记物分别以红色和蓝色表示。
图2C、基于150个血浆样本qMSP结果的建模研究:4个不同标志物组合的ROC分析。
4个不同组合如下:
3 个甲基化 CpG 位点(cg14263942、cg12701184 和 cg14570307)
6 个甲基化 CpG 位点(cg14263942、cg12701184、cg14570307、cg15457058、cg07689503、cg20172627)、
3 个甲基化 CpG 位点+(AFP 和 DCP)
6甲基化 CpG 位点+ (AFP 和 DCP)
括号中的数字是AUC值。
表1 ROC分析结果:10个高甲基化CpG位点的qMSP检测性能评估(基于150个血液样本)
图 3 HepaClear面板 在训练集和验证集中的性能表现:ROC分析
图3A和B: HepaClear面板在训练组中的表现:所有肝癌分期的患者 (A) 和早期患者(B)比较;HepaClear 面板与单独使用蛋白标志物AFP 和 DCP 的性能比较。可以看出HepaClear面板的预测效果优于蛋白标志物AFP 和 DCP。对晚期的预测效果尤佳。
图3 C和D :不同病程(健康对照、CHB、LC 和 HCC) 患者的HepaClear 面板综合得分分布图。可以看出,HepaClear 面板在健康组中综合得分最低,病期越晚得分越高,肝癌患者评分最高。训练集与验证集结果一致。
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