活性氧及其与放线菌关系的新发现

 氧是维持动物和好氧微生物生命不可缺少的重要元素。没有氧气，动物很快死亡，所有好氧微生物不能生长、繁殖。植物生长不需要氧。在光照条件下，植物进行光合作用时，还会通过水的光分解向环境中释放氧气O₂，植物能利用从水分子中分解释放出来的两个氧原子形成一个氧分子O₂，进入空气。

 空气中约有20%的成分是氧气，以分子态O₂的形式存在，其化学性质十分稳定。

 植物在生长发育中，除了形成分子态氧外，还会通过有氧代谢在植物体内形成多种含有氧原子的化合物。这些含氧化合物的化学性质极不稳定, 非常活跃，易与植物体内的蛋白质、脂类等多种生物大分子反应，或破坏生物大分子的化学结构，对植物细胞造成伤害；或对植物细胞产生其他有益作用。

 通常将植物体内化学活性非常强的含氧化合物称为“活性氧”，以与化学性质非常稳定的分子态O₂加以区别。不仅植物体内含有活性氧，动物体内也含有活性氧，会造成动物衰老、病变等不良反应。

 生物体内常见的活性氧有3种：

 超氧化物阴离子自由基(O^2-)，过氧化氢(H₂O₂),羟基自由基（·OH）。

 研究发现，植物体内的活性氧具有多种生理功能：在其含量适合的情况下，对植物有益，如增强植物的抗病性和抗逆性，调节植物生长；当其含量过高时，则对植物有害：损伤植物细胞质膜，或使植物细胞内的某些酶失活。

 为了防止活性氧过量对植物造成伤害，植物在长期进化过程中形成了多种调节机制，酶解转化就是活性氧的主要调控机制之一，即通过植物体内一些特定的酶将过量的活性氧转化为无毒形式。如当植物体内的O^2-数量过多时，植物就通过超氧化物歧化酶（SOD）,将O^2-转化为毒性较低的H₂O₂，该物质再通过过氧化氢的专用降解酶过氧化氢酶（CAT），将H₂O₂转化为H₂O和氧气O₂，彻底消除这两种活性氧对植物的毒性。

  当植物遭受病原菌攻击罹病时，植物体内的活性氧会快速大量增加，形成所谓的“活性氧爆发”，启动植物针对病原物的“自卫反击战”：利用活性氧破坏病原菌的细胞质膜，使病原菌细胞结构崩溃失活；对植物细胞壁上的结构性多糖链、蛋白质链进行反复交联加固，使植物细胞壁上的多糖网、蛋白质网更为密集坚固，加强植物自身的抗病性，以抗御病原菌分泌的“化学武器”对植物细胞壁的溶解破坏。病原菌的化学武器实际上是一些水解酶，能溶解植物细胞壁纤维素、果胶质、葡聚糖及蛋白质，使细胞结构崩溃，细胞失去活性。活性氧对植物细胞壁的加固作用在病原菌攻击开始二、三分钟就启动，半小时左右加固完成。活性氧还能使寄主植物细胞壁木质化，增强植物对病原菌的抵抗能力。此外，“活性氧爆发”还能引起寄主植物细胞发生“过敏性死亡”，在植物叶片上形成大量死亡枯斑，将叶片病害限制在一定范围内，防止病害扩展蔓延至整个叶片。

 植物体内活性氧对植物健康生长、抗病的作用已有大量研究，尚不清楚活性氧对植物的次级代谢产物累积有何影响。如何调控植物体内活性氧含量，使植物生产按人类期望的方向进行，是值得探索的问题。

 我们的研究发现： 

 放线菌能调节植物叶片及根系内活性氧含量：

 或使活性氧减少^[1]，或使活性氧增加^[2]，影响植物抗病性^[1]及生长^[2]；并对植物次级代谢产物累积产生显著影响^[2]。

发现1：放线菌能降低番茄叶片中活性氧含量

 李玉龙等在研究放线菌对番茄卷叶黄化病毒病的防效时发现，向番茄种植土壤中穴施放线菌活菌，或向番茄育苗基质中接种放线菌活菌，均能引起番茄叶片中O^2-和H₂O₂含量大幅度减少（图1），与此同时，伴随着番茄卷叶黄化病毒病减轻^[1]。

 图1中，番茄叶片上的深色斑点代表番茄叶片中H₂O₂的聚集区。图1显示，放线菌处理后，番茄叶片上的深色斑点面积（H₂O₂聚集区）占叶片总面积的比例较对照减少62%，达到统计上的显著水平，意味着放线菌接种处理叶片中活性氧H₂O₂的含量较对照减少62%。与此同时，番茄叶片中O^2-的聚集区面积占总叶面积比例较对照减少了39%^[1]，意味着活性氧O^2- 的含量较对照减少39%。番茄叶片中活性氧减少，意味着放线菌能减轻活性氧对叶片的损害。伴随叶片中活性氧含量减少，叶片中病毒数量同步减少（图2）。

 研究证明，病原物侵染植物时，植物体内会发生“活性氧爆发”，活性氧会大量增加，进而增强植物对病原的抗性。但活性氧过多，对植物叶片细胞膜也有伤害作用。病毒感染番茄时，番茄叶片中的活性氧也会大幅度增加。放线菌降低了番茄叶片中H₂O₂含量，会减轻活性氧对叶片的伤害。

 活性氧减少与病毒量减少之间有何关系，尚不清楚。 

图1 放线菌对番茄叶片中活性氧H₂O₂的影响（李玉龙，2019）

图2 放线菌对番茄叶片中番茄卷叶黄化病毒的影响（李玉龙，2019）

     发现2：放线菌能增加丹参毛状根中活性氧含量

  阎岩研究发现，将培养9天的密旋链霉菌液体培养菌丝体和培养液加到丹参毛状根液体培养体系中，继续培养一定时间，会显著增加丹参毛状根中H₂O₂及O^2-含量 ^[2]。在继续培养至7天、14天时，丹参毛状根中的H₂O₂含量分别为对照的2.1倍、1.8倍（图3）。

  如果在接入密旋链霉菌的同时，同步加入过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），即密旋链霉菌+CAT，密旋链霉菌+ SOD，继续培养至7天、14天时，两种形式的活性氧含量表现出程度不同减少。

  首先分析H₂O₂的变化。在密旋链霉菌+CAT处理中，毛状根中的H₂O₂含量与未加密旋链霉菌的对照无显著差异，但其H₂O₂含量远低于单加密旋链霉菌处理（图3左）。在培养至7天、14天时，密旋链霉菌+CAT处理的H₂O₂含量较单加密旋链霉菌分别降低约45%、40%，降低量约占密旋链霉菌新增H₂O₂含量的87%、91%，即加入的CAT抵消了密旋链霉菌加入后新增加的绝大部分H₂O₂含量。CAT是H₂O₂的专用降解酶，密旋链霉菌新增加的H₂O₂差不多被CAT全部“吃掉”了。在密旋链霉菌+SOD处理中，H₂O₂含量较单加密旋链霉菌分别降低约30%、19%，降低量占新增H₂O₂量的57%、44%，即SOD能“吃掉”约1/2的密旋链霉菌新增H₂O₂。SOD是O^2-的专用降解酶，不直接降解H₂O₂，不能全部抵消密旋链霉菌新生成的H₂O₂，仅能部分抵消新增加的H₂O₂含量，故在密旋链霉菌+SOD处理中，仍有较多H₂O₂残留，该处理毛状根中的H₂O₂含量仍然较对照高出46%、44%（图3右）。

  其次，再看O^2-命运变化。加入密旋链霉菌后，丹参毛状根中O^2-含量分别约为对照的3倍、2倍（图3右）。在密旋链霉菌+SOD处理中，O^2-含量较单接密旋链霉菌处理约降低48%、43%，对O^2-的抵消量约占密旋链霉菌新增O^2-量的78%、75%。即SOD能显著抵消密旋链霉菌加入后新增加的O^2-含量。CAT不是O^2-的专性降解酶，故在密旋链霉菌+CAT处理中，O^2-含量与单纯加入密旋链霉菌相比，减少幅度很小，加密旋链霉菌+CAT处理与单独加入链霉菌处理无显著差异，但与不加链霉菌对照差异极显著（图3右）。

图3.丹参毛状根中过氧化氢H₂O₂和超氧阴离子O^2-含量（阎岩，2014）

发现3：活性氧与丹参毛状根生长存在相关性

  活性氧增加对植物生长有何影响？

  研究发现：加入放线菌后，伴随活性氧增加，丹参毛状根生物量减少。

  加入链霉菌，培养至7天、14天时，单接链霉菌处理，丹参毛状根的生物量较对照分别减少11%、22%，说明放线菌接种导致“活性氧爆发”，对丹参根系生长有一定抑制作用。在密旋链霉菌+CAT处理中，密旋链霉菌新增加的活性氧H₂O₂绝大部分被CAT降解消除，活性氧对根系生长的抑制作用大部分解除，丹参毛状根生物量仅比对照减少4%、6%；在密旋链霉菌+SOD处理中，丹参毛状根生物量仅比对照减少2%、6%，表明用降解法减少植物体内活性氧H₂O₂及O^2-含量，均能显著减轻活性氧对丹参毛状根生长的不良影响。

图4.放线菌对丹参根系生物量的影响（阎岩，2014）

发现4：活性氧含量与丹参毛状根中

药用有效成分含量存在显著正相关性

  丹参毛状根中活性氧对丹参次级代谢产物合成有无影响，有何影响？是一个值得研究的问题。

  如果活性氧能提高丹参中有效成分的合成量，则可以在生产中通过施用放线菌的方法提高丹参根系中的活性氧含量，进而提高丹参根系药用器官的药材质量。

  阎岩研究表明，放线菌能显著提高丹参毛状根中丹参酮含量。在加入放线菌的毛状根中，总丹参酮含量最高约为对照的10倍，其中隐丹参酮含量在接种后第14天约为对照的60倍，二氢丹参酮，丹参酮1和丹参酮2A最高分别为对照的10倍，2倍和3倍^[2]。

  上述丹参有效成分是在丹参根系中活性氧大幅度增加的情况下合成的。

  如果将放线菌新增加的活性氧用各种活性氧专用降解酶分解除掉，测定丹参酮等药用成分变化，就能部分说明活性氧对丹参次级代谢产物累积的作用。与单独使用密旋链霉菌相比，在密旋链霉菌+CAT 的毛状根中，用CAT降解丹参根系中因密旋链霉菌接种引起氧爆发产生的H₂O₂后，二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮1和丹参酮2A含量最大下降幅度分别为79%，83%，38%和41%，总丹参酮含量最大降幅为71%；在密旋链霉菌+SOD的毛状根中，用SOD降解密旋链霉菌接种引起的丹参根系中新增加的O^2- 后，二氢丹参酮，隐丹参酮，丹参酮1和丹参酮2A含量最大降幅分别为79%，84%，38%和57%，总丹参酮含量最大降幅75% (图5)。活性氧增加，丹参毛状根中药用有效成分大幅度增加；用活性氧降解酶消除新增加的活性氧，丹参毛状根中新增药用有效成分大幅度减少。上述两组同步性数据充分说明，丹参毛状根内活性氧含量与丹参药用次级代谢产物合成累积量密切相关，其机理尚不清楚。 

图5.放线菌对丹参药用成分含量的影响（阎岩，2014）

 植物体内的活性氧是一把双刃剑，当遇到环境中病原物攻击时，植物体内活性氧爆发，活性氧含量大幅度增加，植物对病原物的抗病性大幅度提高，以保证植物在自我防卫中取胜。活性氧过量时，在抵抗或消灭外来进攻的病原物时，活性氧不可避免伤害自身细胞，造成植物生长减慢。

 在没有病原物存在时，用链霉菌“启动”丹参根系内活性氧爆发，促进丹参根系内药用次级代谢产物大量累积，在用于中药栽培生产时，对提高中药品质有重大意义。至于活性氧含量与丹参毛状根内药用有效成分累积之间的详细关联机制，尚待后续深入研究揭示。

参考文献

1.Yulong Li.Qiao Guo.Yunzhou Li.Yifan Sun.Quanhong Xue.Hangxian Lai.Streptomyces pactum Act12 controls tomato yellow leaf curl virus disease and alters rhizosphere microbial communities.Biology and Fertillity of Soils (2019)55:149-169

2.阎岩，赵欣，张顺仓，刘岩，梁宗锁.活性氧在密旋链霉菌 Act12 诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用.中国中药杂志.2014.39（11）：1985-1991