今年的7月28日是第12个“世界肝炎日”，课题组发布此报告，以纪念乙肝病毒的发现者和第一个乙肝疫苗的发明者Baruch S Blumberg教授(1925-2011)，感谢为中国控制乙肝病毒感染而付出艰辛努力的所有人员。国内涉及乙肝病毒的基础研究众多，肯定有不少遗漏之处；文中描述肯定也有不当之处，敬请大家谅解，并望能告知，以进一步学习和完善。

期待全国的基础-临床等多学科工作者合作共享、协同创新，一起提升我国在乙肝病毒研究领域的原始创新水平并开展转化研究，为早日达到慢乙肝治愈、实现“没有肝炎的未来”作出中国贡献。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）作为病毒性肝炎的首因，其慢性感染及所致肝脏疾病严重危害健康，国民疾病负担沉重，尤其我国超85%的原发性肝癌与乙肝迁延不愈相关。随着乙肝疫苗接种新发病例已大幅降低，但据WHO最新统计，全球目前仍有约2.96亿HBV携带者，2019年约82万人死于HBV感染所致疾病[1]，我国每年新发乙肝病例仍有约百万。目前临床用于治疗慢性乙肝的药物主要有两大类，包括核苷（酸）类似物（NAs）和α干扰素（IFN-α），但尚不能有效清除病毒及治愈乙肝，大量慢乙肝患者需长期乃至终身抗病毒治疗[2]。因此，慢性HBV感染亟需新型治疗策略的开发和潜在治疗靶点的发掘，而这依赖于对HBV基本生物学特性和慢性化感染机制的深入研究。

过去十年中，我国病原、免疫、感染、生命科学及生物医药等各学科科技工作者们做出了很多原创性的工作，使我国的HBV科学研究水平和国际影响力有了显著提高，并为消除病毒性肝炎危害提供了重要基础。本文尝试从HBV分子生物学与模型、HBV与宿主相互作用、HBV免疫学以及HBV的干预策略等方面对近十年来我国在HBV基础研究领域的主要进展作一综述。

一、HBV细胞和动物模型与新的检测技术

HBV具有严格的种属嗜性，仅人和黑猩猩等灵长类动物可以自然感染HBV，该特性限制了对HBV的基础研究。2012年李文辉团队利用近零距离光交联和串联亲和纯化，鉴定到了HBV入胞的功能性受体——NTCP[3]，极大促进了基于人肝癌细胞的HBV感染细胞模型建立和HBV分子生物学的研究，具有里程碑式的意义。原代人肝细胞（PHH）因更接近真实肝细胞生理功能，仍是研究HBV重要的细胞模型。然而PHHs在体外培养的稳定性差，离体后会迅速去分化，这限制了它的应用范围。2019年邓宏魁等团队筛选到PHHs长期培养所需的5种小分子化合物（5C），实现了体外PHHs延长培养及支持HBV感染至4周以上[4]。

鉴于小鼠模型的优点，国内外学者在转基因小鼠的基础上致力构建持续表达抗原和形成cccDNA的HBV小鼠模型。早期研究通过高压尾静脉注射将1.3×HBV基因组引入小鼠体内，可在两周内检测到HBV复制产物[5]。2014年邓强团队基于cre/loxP将单拷贝的HBV基因组构建入腺病毒载体，运用高压尾静脉注射Alb/Cre小鼠建立了重组cccDNA（rcccDNA）小鼠模型，该小鼠血清HBsAg水平可维持长达9周[6]。邓强和本课题组分别通过在rcccDNA质粒上添加了B2M shRNA表达框及运用AAV8载体抑制宿主免疫进一步优化了该模型，可使HBV持续存在长达50-60周[7, 8]。此外，高路团队利用噬菌体ΦC31整合介导的分子内重组技术制备了与天然cccDNA高度相似的HBV circle，可在小鼠肝脏内启动病毒复制和抗原表达[9]。

由于HBV转染小鼠模型不能支持HBV感染的完整周期而受到应用限制，故人源化小鼠模型的探索不断展开。前期研究包括将HepAD38细胞移植到裸鼠体内，以及基于尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂（uPA）转基因的肝嵌合小鼠（如uPA-SCID小鼠）等[10, 11]。uPA-SCID小鼠为HBV的研究提供了重要的帮助，但是存在模型建立困难的问题。夏宁邵团队通过将不同肝分化状态的HepaRG细胞移植到免疫缺陷小鼠中，开发了一种基于HepaRG的人肝嵌合小鼠模型，可以支持HBV持续24周的感染[12]。2019年夏宁邵等团队还通过移植人骨髓间充质干细胞，构建了肝脏和免疫细胞双重人源化的小鼠模型，模拟了HBV自然感染诱发的慢乙肝肝硬化的发病过程[13]。相关人源化小鼠模型的进一步完善将对HBV感染与发病机制的研究有重要帮助。

HBV cccDNA持续存在是慢乙肝难以治愈的关键，但肝细胞中cccDNA含量低，难以检测限制了对HBV持续存在的认识。2016年本课题组改进了ViewRNA技术，成功建立了一种高灵敏度与特异性的cccDNA的组织原位杂交方法[14]。将原位杂交结合免疫荧光检测发现HBV慢性感染患者肝内的HBV核酸与HBsAg信号呈互斥分布，并提出在单细胞水平上HBV存在3种不同的复制阶段，增进了对乙肝自然史的认知。以往认为cccDNA的半衰期为十几年，2021年孙剑等团队以拉米夫定耐药位点作为特异性标记，计算出cccDNA的半衰期在6个月左右[15]。在cccDNA血清标志物研究方面，鲁凤民团队对血清HBV RNA的性质、来源等进行了研究，对慢乙肝患者血清中RNA进行qPCR检测发现血清HBV RNA主要为pgRNA，并存在于病毒样的颗粒中[16, 17]。本课题组也进一步证明血清中RNA为pgRNA及其降解产物[18]。后续国内外临床队列研究进一步提示血清HBV RNA与cccDNA转录活性存在相关性[19]，血清HBV RNA作为一种新型标志物已被写入2019年中国慢乙肝防治指南，其在评估NAs停药后复发风险等方面的应用值得深入研究。

二、HBV与宿主细胞相互作用

一般认为，HBV感染不直接引起细胞病变，即HBV在感染细胞内复制增殖不会引起细胞变性、死亡裂解等细胞损伤。但是与所有病毒类似，HBV生命周期的完成高度依赖宿主细胞，它需要利用宿主细胞的物质和能量来进行自身的转录复制以及蛋白表达，维持基因储存库的存在。对宿主细胞来说，面对HBV的感染，其也会发生一系列反应来应对病毒复制。

HBV感染细胞后，会在细胞核内建立起cccDNA池，cccDNA是HBV转录复制的模板。金东雁团队鉴定到可促进cccDNA转录的宿主因子--CREB调节转录共激活因子1（CRTC1），这为研发抗HBV药物提供了潜在的靶点[20, 21]。2019年黄爱龙团队揭示了泛素结合酶基因UBE2L3通过泛素-蛋白酶体途径促进APOPEC3A的降解，从而有利于cccDNA的持续存在[22]。在HBV宿主限制因子研究方面，本课题组于2017年鉴定发现与cccDNA表观抑制相关的宿主限制因子--蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT5）[23]；2018年和2019年陈新文和黄爱龙等团队相继报道cccDNA抑制性表观调控宿主因子，包括Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶家族中的SIRT3和组蛋白去乙酰化酶11（HDAC11）[24, 25]。这些研究揭示了宿主借助表观修饰抑制cccDNA转录活性的机制。本课题组进一步发现，不同表观修饰、转录状态的cccDNA在抗清除性方面不同，提示表观状态在调控cccDNA活性和稳定性方面的重要作用[26]。除表观状态外，cccDNA的转录活性还被报道与其所处的空间位置有关，2019年李文辉团队研究表明转录无活性的cccDNA倾向于在特定区域（包括靠近19号染色体的区域）[27]。鲁凤民团队进一步证实细胞转录阴阳蛋白1（YY1）和HBx介导cccDNA募集到19p13.11区域以进行转录激活[28]。随着HBV转录限制因子SMC5/6复合物被鉴定，吴建国团队于2019年部分阐明了SMC5/6的作用机制，证明SMC5/6在环- h2 E3泛素连接酶PJA1的介导作用下结合到染色体外的游离病毒DNA上，进而抑制其转录复制[29]。

研究发现，HBV除可以通过宿主因子达到完成转录复制的目的外，还会诱导宿主细胞发生某些反应来促进其自身的生命活动，如自噬反应。本课题组在2011年发现HBV的表面抗原可以通过诱发感染细胞的自噬反应来促进病毒复制[30]；2017年熊思东团队进一步揭示HBV通过HBx诱导宿主细胞自噬的信号通路是Ⅲ型PI3K(VPS34)/beclin-1，而不是Ⅰ型PI3K/AKT/mTOR[31]；2019年郭德银团队报道了HBx通过与c-myc结合抑制miR-192-3p的表达进而诱导感染细胞自噬反应的新机制[32]。我国学者关于HBV诱导细胞自噬的相关研究不仅完善了HBV与宿主相互作用的机制研究，也有助于寻找慢乙肝的新型标志物和治疗靶点。

随着高通量测序技术的普及，近年来胡荣贵和本课题组等团队利用HBV复制模型prcccDNA/Cre结合HBV 5C-PHH感染系统等进行了转录组学、蛋白质组学的相关分析，系统呈现了HBV复制状态以及长期感染状态下宿主细胞转录谱和蛋白谱发生的变化，并鉴定出了一些与HBV生命周期相关的一些宿主因子[33, 34]，这些结果有助于HBV研究者从整体水平去理解HBV感染之后与宿主细胞之间的相互作用。

三、HBV免疫学

1、免疫清除机制

I型IFN作为天然免疫的第一道防线，可通过诱导抗病毒细胞因子和促进免疫细胞激活而发挥抗HBV效应。大量临床应用已经显示IFN可用于治疗HBV，虽然其应答率也较有限[35]。王勇翔团队发现干扰素可通过诱生干扰素刺激基因（ISG）MX2、抑制病毒松弛环状DNA（relaxed circular DNA）转化成cccDNA和选择性降低病毒RNA转录发挥抗病毒作用[36]。唐红团队发现外源性IFN-α治疗CHB不应答与干扰素诱导跨膜蛋白2（IFITM2）表达、作用于树突细胞而负调IFN-α抗病毒信号通路有关[37]。本课题组研究表明，HBV对IFN-α抗病毒的敏感性与细胞自身干扰素反应性密切相关[38]，不同IFN-α亚型抗HBV的效应不同，其中IFN-α14被鉴定为能够有效改善干扰素低应答且抗HBV效果高于临床应用IFN-α2的亚型，可协同激活肝内I型和II型IFN通路从而高效抑制HBV[39]。此外，外泌体被发现具有传递IFN-α诱导的抗病毒效应的功能，巨噬细胞可通过外泌体传递IFN-α诱导的众多抗病毒效应分子至HBV复制的肝细胞中，发挥IFN-α抗病毒活性从而干扰抑制HBV在肝细胞中的复制[40]。

HBV感染如何启动宿主天然免疫和适应性免疫，以及涉及哪些免疫细胞和分子的参与是HBV免疫学研究中关键的问题。最近，王福生院士团队等合作对HBV感染的免疫耐受（IT）、免疫活性 (IA)、急性恢复 (AR)、慢性消退（CR）等阶段患者和HBV的健康对照（HC）的肝脏和血液样本进行单细胞RNA测序，首次深度剖析了HBV感染不同阶段的肝脏和外周免疫微环境特点，发现IA和AR观察到肝内耗竭的CD8+ T细胞的扩增具有不同的来源和细胞相互作用[41]。杨东亮团队研究发现急性HBV清除过程中T细胞应答发生的新机制：肝脏基质金属蛋白酶MMP2/MMP9表达水平升高介导外周免疫器官中T细胞和NK细胞膜上CD100的剪切释放形成可溶性CD100，诱导树突细胞（DC）、肝窦内皮细胞（LSEC）等抗原递呈细胞的活化，促进肝内HBV特异性CD8+ T细胞应答并介导病毒的肝内清除[42]；此外，刘嘉等发现HBeAg可参与调控肝内免疫微环境，诱导LSEC活化分泌TNFα和IL-27，从而促进T细胞发挥其抗病毒效应功能[43]。

近年来，特定免疫细胞群体在HBV清除过程中发挥的作用逐渐被发现。翁秀芳/吴雄文团队发现人体肝脏内富集的新型固有免疫样T细胞——MAIT细胞，分泌大量抗病毒细胞因子、具有抗HBV潜力，而在慢乙肝患者体内高水平的血清直接胆红素会导致MAIT的数量及功能缺陷[44]。侯金林团队研究表明CXCR5+CD8+T细胞亚群在HBV复制小鼠模型中可促进HBsAg清除，在慢性HBV感染者肝内CXCL13水平升高可募集CXCR5+CD8+T细胞亚群到肝内发挥抗病毒作用[45]。邓国宏团队将HBV特异性CD4+ T细胞根据TNF-α及IFN-γ分泌能力分为不同的功能亚群，其中分泌TNF-α的细胞向分泌IFN-γ的细胞分化利于患者病毒清除，该分化过程伴随着T细胞特化转录因子T-bet、效应分子IL-21的上调[46]。

2、HBV免疫逃逸与肝脏免疫耐受机制

HBV可通过自身蛋白与宿主的相互作用来逃避宿主的先天免疫反应。朱应团队发现，HBV抗原（HBsAg 和HBeAg）通过竞争性结合穹隆主体蛋白（MVP）的MyD88 结合区域，限制下游 IFN 信号传导[47]。本课题组研究表明，HBV pol可通过抑制PKC-δ和importin-α5损害IFN-α诱导的STAT活化，还可与STING直接相互作用并随后破坏其K63连接的泛素化，抑制IFN-β产生[48, 49]。张继明等团队发现HBV前核心蛋白p22可以阻遏pSTAT1的入核转位，从而抑制IFN信号通路[50]。马春红团队研究发现，HBx通过转录因子YY1反式激活ADAR1转录，ADAR1能够结合并编辑HBV RNAs，抑制模式识别受体RIG-I/MDA5对HBV RNAs的结合，因而负调控IFN信号通路活化[51]。刘实团队揭示HBV还可以通过调节细胞代谢而逃避固有免疫识别——HBV可促进葡萄糖糖酵解作用产生乳酸，减弱RIG-I样受体（RLR)-线粒体抗病毒信号蛋白MAVS信号传导[52]。此外，前述在HBV感染中可发挥抗病毒作用的外泌体，张建团队发现可能同时具有参与HBV播散、损害NK细胞功能并抑制其模式识别受体表达的作用[53]。

机体对HBV的免疫耐受是HBV感染慢性化的一大关键。田志刚院士团队利用pAAV/HBV1.2质粒高压注射的慢性HBV携带小鼠模型，研究了IL-10依赖的HBV免疫耐受机制，发现慢性HBV感染小鼠对外周疫苗无应答的体液免疫耐受与Kupffer细胞及其高表达的IL-10有关[54]；Kupffer细胞能够诱导肝脏I型调节性T细胞产生IL-10，抑制Tfh和生发中心B细胞反应而阻断体液免疫应答[55]；Kupffer细胞还可通过TLR2受体直接识别HBcAg产生IL-10，诱导HBV特异性CD8+ T细胞的耗竭[56]。此外，慢性HBV感染IL-10的产生可促进NK细胞上调抑制性受体表达，而减弱NK细胞清除HBV的能力[57]；而涂正坤团队的研究表明NK细胞还参与到HBV感染中的免疫抑制级联效应，即HBV诱导产生抑制性单核细胞，启动调节性 NK 细胞分化而导致T细胞抑制[58]。在此HBV持续性诱导的全身耐受小鼠模型中，CD4+T细胞持续分泌γ-干扰素可诱导肝脏巨噬细胞产生CXCL9，促使抗病毒CD4+T细胞滞留在肝脏发生凋亡[59]。单核细胞髓系抑制细胞（mMDSCs）与HBV免疫耐受之间的联系在近年来得到了进一步的认识。张继明团队发现，HBeAg诱导的mMDSCs扩增通过IDO途径损害T细胞功能，在体外可显著降低CD4+和CD8+ T细胞的增殖及IFN-γ的产生，从而有利于持续性HBV感染的建立[60]；田志刚院士团队发现γδT细胞也可通过分泌IL-17招募mMDSCs进入肝脏而抑制HBV特异性T细胞功能[61]。本课题组研究表明，HBsAg在体外可以通过ERK/IL-6/STAT3直接促进外周血中单核细胞转化为mMDSC[62]，并且这些mMDSCs能携带HBsAg迁移到胸腺中，进而清除尚未发育成熟的HBsAg特异性T细胞[63]。这一工作不仅阐明了HBsAg特异性T细胞耐受环境的形成机制，也解释了HBV感染婴幼儿患者容易慢性化的原因。

四、HBV免疫干预策略

增强宿主固有免疫或诱导HBV特异性适应性免疫应答有助于控制和清除HBV持续性感染。RIG-I激动剂、STING激动剂及TLR激动剂等模式识别受体激动剂是增强固有免疫的主要策略，目前已有多种药物在临床前试验中表现出良好的治疗效果并进入临床试验研究[64, 65]。近几年我国在抗HBV免疫干预策略方面也进行了广泛深入的研究。

1、治疗性疫苗

张建团队的研究显示，以Poly I:C为佐剂的HBV治疗性疫苗在HBV小鼠中通过产生HBV特异性CD8+效应T细胞清除HBV，可以很好地预防HBV治疗后的再感染[66]。除了常规的HBsAg疫苗，preS1多肽疫苗接种在HBV小鼠中也可诱导强烈的免疫反应，甚至降低了HBsAg的耐受状态，提示其作为控制CHB治疗性疫苗的潜力[67]。朱明昭等团队设计了基于铁蛋白纳米颗粒的HBV preS1纳米疫苗，在小鼠模型中可诱导高水平、高亲和力、持久的抗体应答和免疫记忆，且铁蛋白纳米颗粒抗原可被淋巴结SIGNR1+抗原呈递细胞主动靶向识别、转运、诱导Tfh和B细胞活化应答[68]。

夏宁邵团队通过功能抗体靶向筛选技术，确定了识别非免疫优势sA表位的E6F6单克隆抗体，在动物体内表现出持久有效的HBsAg清除功能[69]。基于此，该团队以蹄蝠肝炎病毒衣壳蛋白优化改造出一种新型类病毒颗粒为载体，设计出展示sA表位的B细胞表位嵌合型类病毒颗粒乙肝治疗性疫苗，在多种HBV持续携带小鼠模型和非人灵长类（食蟹猴）中刺激机体产生高滴度的sA表位抗体，可有效清除HBV携带小鼠体内的病毒[70]。

目前我国研发的进入临床试验的治疗性疫苗为闻玉梅院士团队领衔的YIC疫苗（乙克）和吴玉章团队领衔的εPA-44（伊帕）。YIC疫苗为以铝作为佐剂的HBsAg和人抗-HBs免疫球蛋白复合物，通过促进抗原呈递细胞的抗原摄取而启动适应性免疫应答，在多中心、随机、双盲、安慰剂对照的III期临床试验结果中发现YIC所致HBeAg血清转换率与铝佐剂组类似[71]。作为首个进行III期临床试验的慢性乙型肝炎疫苗，YIC的开创性研究和进一步揭示相关免疫保护机制为慢乙肝免疫治疗提供了宝贵经验。εPA-44是利用“模拟抗原”的治疗性疫苗策略、基于脂质体的多肽纳米颗粒亚单位疫苗，在最近公布的长达144周的II期临床试验显示了其在慢乙肝治疗中的安全性和临床效果，目前正在进行III期临床试验 [72]。

2、免疫检查点抑制剂

针对PD-1等免疫检查点分子的免疫治疗策略广泛用于癌症和慢性感染疾病的治疗[73]。杨东亮等团队发现在慢性HBV感染中，阻断PD-1/PD-L1通路可联合抗病毒和DNA疫苗治疗，增强HBV特异性CD8+ T细胞清除HBV功能[74]。唐丽/贺福初院士发现针对免疫检查点CTLA-4的抗体抑制Treg细胞活性，可恢复Tfh细胞的清除HBV效应[75]。田志刚院士发现协同抑制受体TIGIT的抑制性通路在HBV转基因小鼠中可以维持CD8+ T细胞耐受，阻断TIGIT通路可有效活化HBV抗原特异性的CTLs[76]。跨膜糖蛋白Tim-3也是一个重要的免疫检查点靶点，马春红团队发现在慢性HBV感染中，Tim-3在多种免疫细胞中上调表达，而阻断Tim-3可增加IL-4、TNF-α、IFN-γ等炎症因子的表达，有效改善iNKT细胞功能并抑制HBV复制[77]。

3、细胞因子

除了干扰素这一经典的抗HBV治疗的细胞因子外，临床前研究提示IL-21表现出有效的抗HBV潜力。侯金林团队发现，慢乙肝患者抗病毒治疗12周以后，IL-21水平升高可预测HBeAg的血清学转换，提示IL-21在慢乙肝免疫治疗中的作用[78]。谢幼华/张继明团队通过临床分离HBV毒株BPS在免疫健全小鼠体内建立持续性HBV感染模型，发现IL-21及IL-33表达质粒的注射有助于HBV慢性感染小鼠清除HBV[79]，进一步发现基于IL-21的疗法可通过活化CD8+ T细胞清除肝脏cccDNA并形成长期保护记忆[80]；含有IL-21基因的5c3c衍生的重组HBV复制子在HBV感染的体内外模型中均具有高效复制性且产生包膜病毒粒子，持续表达的IL-21可诱导HBV的清除[81]。另外，田志刚院士团队的研究结果表明IL-12可通过促进HBV感染小鼠肝内CD4+ T细胞的免疫应答来抑制HBV复制[82]；低剂量的IL-2可以在干扰素治疗无应答的患者中帮助恢复T细胞应答，并促进HBeAg转阴[83]。

4、“三明治”疗法

基于乙肝慢性感染的病原学和免疫学机制，闻玉梅院士提出乙肝治愈的“三明治”策略：将抗病毒小分子药与针对乙肝表面抗原的单克隆抗体联用，使病毒和乙肝表面抗原短期内降低，从而打开一个免疫干预窗口，使用治疗性疫苗进行主动免疫，诱导病人自身产生抗乙肝表面抗原的抗体，以达到功能性治愈慢性乙肝[84]。在乙肝慢性感染的动物模型中，采用抗病毒药物替诺福韦酯（TDF）、强效抗乙肝全人源中和抗体G12和乙肝治疗性疫苗（mYIC）的联合证实了“三明治疗法”的可行性，有效地降低了慢乙肝小鼠模型血清和肝脏中的HBV抗原表达，还激活了小鼠产生抗乙肝表面抗原抗体的体液免疫应答和抗病毒细胞免疫应答[85]。更高效和广谱的抗病毒中和抗体的筛选研制可为类似疗法提供更多的技术支撑，如王乔团队从特定的个体中克隆人源抗-HBs，并鉴定出广谱中和性抗体（bNAbs），发现可预防或治疗HBV感染的人源化转基因小鼠[86]。 

结语

在HBV研究模型方面，尽管HBV功能性受体NTCP的发现促进了HBV在人肝癌细胞系中的感染，但有效感染依赖较高浓度的HBV，因此HBV的感染是否存在其它的共受体仍有待进一步研究，且HBV的感染仍缺少简便易操作的动物模型。在cccDNA的生物学研究方面，cccDNA的形成、转录调控与清除的相关机制有待进一步研究，研发干预清除cccDNA和乙肝表面抗原的靶点和策略是乙肝治愈研究中一大核心。另一关键问题是，在乙肝病毒慢性感染过程中，免疫耐受和耗竭的梯度特征有待阐明。结合前沿技术手段，进行相关表征机制的定量化解析，将有助于研发打破耐受和恢复抗病毒免疫的新型策略。在HBV检测手段方面，需要对cccDNA及HBV RNA、HBcrAg等血清标志物的检测进行标化和优化，以及开发新的免疫血清标志物。

丙肝病毒研究历程的启示基础研究始终是药物靶点、研究模型及疫苗研发的起点；多学科和团队合作是肝炎病毒研究取得突破的关键；大量科学家和药物研发企业等的通力合作是从实验室到患者的重要一跃。期待全国的基础-临床等多学科工作者合作共享、协同创新，大力提升我国在乙肝病毒研究领域的原始创新水平，充分发挥生物医药产业优势开展转化研究，为早日达到慢乙肝治愈、实现“没有肝炎的未来”作出中国贡献。