不同海拔热带昆虫的高温耐受性研究

报告人：中国科学院大学2021级硕士研究生，刘桓吉

导    师：中国科学院动物研究所，张彦周、朱朝东

一、原文信息

Limited tolerance by insects to high temperatures across tropical elevational gradients and the implications of global warming for extinction

Carlos García-Robledo, Erin K. Kuprewicz, Charles L. Staines, Terry L. Erwin, and  W. John Kress

Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Jan 19; 113(3): 680–685. 

Published online 2016 Jan 4. doi: 10.1073/pnas.1507681113

二、 摘要

        最大临界热值（The critical thermal maximum）(CTmax)是动物丧失自主运动控制的温度，它有可能决定物种是否能忍受全球变暖。对于昆虫来说，对高温的耐受性随着纬度的增加而降低，这表明在海拔梯度上也可能存在类似的模式。本研究探讨了宽和窄海拔梯度分布的不同热带植食性昆虫（卷叶甲虫）的物种和种群CTmax的差异。利用6948次野外观测和8700个博物馆标本的数据，作者绘制了哥斯达黎加两座山脉卷叶甲虫的海拔分布。在所有梯度上，测定了1252只代表所有种群的甲虫个体的CTmax。初步的形态鉴定表明：共有26种在不同海拔的种群显示出不同的热上限。然而，与形态学鉴定相比，DNA条形码(COI)显示出显著的隐存种多样性。DNA条形码从11个物种复合体中鉴定出27个物种和单倍型。这42个分子界定物种的海拔分布和CTmax值，比26个形态学鉴定物种要窄得多。一般来说，在中海拔和山顶上发现的物种，对高温的耐受性低于低地栖息地的物种。海拔分布广泛的物种，在其整个分布范围内都显示出较高的CTmax。我们在CTmax、地理和海拔范围内没有发现显著的系统发生信号。大多数卷叶甲虫，特别是高海拔物种的CTmax值的狭窄的变化表明：在某些全球变暖的预期速率下，昆虫灭绝的风险可能很大。

 三、研究背景

       热极限决定了生物体的地理分布、对当地的适应能力和对全球变暖的生物应答。热适应假说提出：由于适应广泛的温度范围具有很高的生理成本，因此可以选用种群和物种的热极限以匹配其相应温度的地理范围。因此，高温耐受性被认为是一种保守的性状，具有有限的表型可塑性和进化性。这种对表型和进化反应的限制，对全球变暖下的生物构成了严重威胁。

       在热带地区，环境温度全年都保持相对稳定。然而，温度随海拔升高而下降的速率在赤道附近最高（海拔每升高一公里降温6.5℃）。因此，随着热带生物区系随海拔高度的变化，热带生物区系表现出急剧的转变。在变温动物中，如植食性昆虫，在面对热带山脉中较短时间内的较大范围面积的温度变化时，它将选择进化出较为狭窄的热极限。热适应假说的一个核心预测是，相比于高海拔地区的物种，生活在低海拔的热带昆虫对高温有更大的耐受限度。这种模式的一个潜在例外是热带高山生态系统中存在的变温动物，它们在白天和晚上将经历极端的高温和低温。

       为了确定植食性昆虫对高温的耐受性如何随海拔梯度而变化，应考虑以下生物地理、分类和生理的信息。现在面临三个挑战：1、首先，需要准确估计植食性昆虫物种的海拔分布。不幸的是，大多数热带昆虫并不存在海拔分布记录，或者充其量是零星的。2、因为一个物种是分析的单元，其基础分类必须是稳定的，具有良好的支持，并有明确的物种边界。不幸的是，到目前为止，地球上估计的87-300万种昆虫中只有0.3-1.2%被描述过。这个问题可以通过DNA条形码解决。3、评估植食性昆虫对高温的生理耐受性。要使用一种标准的实验室方法去测量最大临界热值(CTmax)。CTmax的估计值高度依赖于实验条件，如初始环境温度条件和温度升高速率。

       对高温的耐受性将决定物种全球变暖下的生存能力。令人惊讶的是，很少有研究去阐明这种特征在相似纬度不同海拔地区，尤其是热带地区的生物中如何变化。DNA条形码表明：以前被认为具有广泛的海拔分布和表型可塑性的热耐受性的昆虫物种实际上构成了隐存种复合体（ cryptic species complexes）。这些隐存种占据了离散的海拔范围，它们的热耐受性似乎在局部适应了它们生存区域的温度。高物种特有性（ high species endemism）和当地对温度条件的适应的结合，可能会增加高海拔昆虫在全球变暖下的灭绝风险。

       本研究的中心目的是根据详细的分布记录，利用DNA条形码鉴定隐存种，了解窄海拔分布和宽海拔分布的昆虫物种对高温的耐受性的差异。对于海拔分布狭窄的物种，我们预计居住在较温暖地区（即较温暖的海拔梯度或低地的生命区）的物种，将比居住在较冷环境中的物种显示出更高的CTmax值。

 四、研究方法

        结合(i)沿海拔梯度分布的植食性昆虫的广泛野外和博物馆记录 (ii)使用DNA条形码对隐存种类群进行鉴定(iii)使用标准化方法记录的CTmax估计值，用以确定植食性昆虫对高温的耐受性，在热带海拔梯度中不同海拔的物种和种群之间的差异。

研究地点和物种：

本研究是在中美洲哥斯达黎加的Barva样带(科迪勒拉山脉中部的东坡10°0’-10°26’N，83°59’-84°07’W)和位于的Talamanca山脉的西坡(8°38’-8°58’N，82°50’-83°05’W)。Barva样带位于哥斯达黎加的北大西洋斜坡上，靠近尼加拉瓜边境，海拔50米至2800米(m.a.s.l.)。从拉塞尔瓦 生物站(La Selva Biological Station)的热带雨林和连接的布劳利奥卡里洛国家公园(Braulio Carrillo National Park)（海拔700米到1070米）的庇护所附近和山地森林（1500米和2100米）收集了卷叶甲虫。全年沿两个海拔梯度的最低温度是相似的。然而，Talamanca山脉的月最高温度比Barva样带沿线的同等生命区高1-3°C。

植食性昆虫的海拔高度分布记录：

为了确定卷叶甲虫沿这两个海拔梯度的海拔分布，我们使用了自2005年以来沿这两个梯度收集的卷叶甲虫的大型数据集。卷叶甲虫的海拔分布是基于对6948个野外记录的形态学鉴定和对来自哥斯达黎加的8700个博物馆标本的修订。海拔分布记录包括在genera Cephaloleia and Chelobasis的两本专著中。凭证存放在昆虫标本馆、国家自然历史博物馆、史密森学会和哥斯达黎加的国家生物多样性研究所(INBio)(Vouchers were deposited in the Entomological Collection, National Museum of Natural History, Smithsonian Institution, and Instituto Nacional de Biodiversidad (INBio) in Costa Rica.）。

CTmax、地理和高度分布的系统发生信号

为了确定潜在的系统发生假重复对热极限分析的影响，我们构建( assemble)了一个代表种群、单倍型和甲虫物种之间的系统发生关系的系统发生树。利用MAFFTV.7对本研究中每个卷叶甲虫种群中代表一个个体的CO1序列进行了校准。我们使用Mr.Bayes3.21(替代模型：HKY85，链长：500000)中的贝叶斯推理方法生成了一个完全解析的树。使用Blomberg’s K方法（package Picante, Program R 3.0.2)检测系统发生信号的存在。

对卷叶甲虫种群CTmax的估计：

为了确定卷叶甲虫的CTmax如何沿海拔梯度变化，我们测量了1252只活甲虫的温度耐受性，代表54个种群中的42个物种和单倍型。在这项研究中，甲虫直接从野外采集，并保存在一个温控实验室中。在实验开始前，甲壳虫被自由喂食，并适应23°C（甲虫每天在每个海拔高度都要经历的一个温度）24小时。在另一个实验中，我们测试了适应时间对本研究中报道的CTmax估计的影响。我们发现适应24-72h后CTmax估计值是相等的；然而，较长的适应时间对卷叶甲虫的生理条件有负面影响，导致某些物种的高死亡率。为了测量CTmax，我们使用了一个由恒温器控制的体积为1000立方厘米的水浴容器。甲虫被放置在单独的猎鹰15ml锥形离心管中。管子被水平放置，漂浮在水浴的表面上。温度传感器被放置在管子内。因此，本研究中报告的温度是15毫升离心管内的温度，而不是实验中使用的甲虫的基础温度。为了模拟卷叶内部的高湿度条件，并确保昆虫的反应是由温度的变化引起的，而不是干燥，我们在每个管内放置一张1×3厘米的湿滤纸。将含有甲虫的试管置于初始温度为23°C的水浴中。温度以1.5°C/min的速率升高，精度为±0.1°C。随着温度的升高，管子被旋转，使甲虫不断地沿着管子的底部行走，靠近水。随着温度的升高，甲虫变得更加活跃，直到达到失去肌肉控制的温度，它们背面朝上上，停止行走（倒地温度knockdown temperatures）。我们使用这些抑制温度作为卷叶甲虫种群和物种的CTmax的近似值。抑制温度取决于实验所选择的温度增长率。在本研究中，我们选择了1.5°C/min的增长率。这一速率至少比昆虫在自然条件下所经历的任何温度上升都要快一个数量级。我们想强调的是，本研究中报道的CTmax估计数，代表了卷叶甲虫种群和物种对高温的相对抗性，而不是种群将在本地灭绝的实际环境温度。

隐存种和单倍型的鉴定：

利用DNA条形码CO1鉴定了卷叶甲虫的隐存种和单倍型。在过去的十年中，大量的研究表明：该分子标记可以在许多类群中非常准确地划分物种。这种DNA条形码在卷叶甲虫种类的鉴定方面特别有效。在之前的研究中，我们能够以100%的准确性识别出所有形态上不同的卷叶甲虫种类。在测定CTmax后，我们收集甲虫置于95%的ET-OH（酒精）中。随后，根据GarcíaRobledo等人描述的方案，取出一条腿进行DNA提取。 序列使用MAFFT进行比对。DNA序列保存在GenBank中（KU357054–KU358485)。

不同生活区类群间CTmax差异的估计：

利用完全交叉方差分析（fully crossed ANOVA）估计了仅存在于一个生活区的甲虫种类之间的CTmax差异。该模型包括海拔梯度、生活区、性别和甲虫类群为因素。响应变量为每个个体的CTmax。性别（雄性和雌性）对任何一个物种的CTmax估计数都没有影响(F1=0.49，P=0.48)。为了确定不同海拔的甲虫物种是否在大小上存在差异，这可能会影响本研究报告的结果，我们测量了本研究中包含的物种的一个子集的长度。我们在海拔（米）和在给定海拔下发现的每个个体的平均长度之间进行了回归分析。我们没有发现海拔与甲虫大小之间的关系(n=779，F1=0.12，P=0.7)。因此，本研究报道的结果不能归因于不同海拔地区物种间大小的差异。对于海拔分布广泛的甲虫种类和在两个或两个以上生活区的种群，我们使用方差分析或Aspin-Welch检验检验了种群间CTmax的差异。模型以生命区为主要因素，响应值为每个种群中每个个体的CTmax。物种和种群之间的差异通过后验检验(Tukey honest significance difference)来确定。所有分析均使用R程序进行。

 五、结果分析

CTmax、地理分布和昆虫高度分布的系统发生信号：

本研究选择近缘物种的一个潜在问题是可能存在系统发生假重复（phylogenetic pseudoreplication）。在我们的分析中，系统发生诱导的偏倚的潜在影响的一个例子是，生活在同一生命区或同一海拔梯度上的物种是近缘的(One example of the potential effects of phylogenetic-induced bias in our analyses is a scenario where species living in the same life zone or at the same elevational gradient are closely related)。如果在同一生活区或海拔梯度分布内的物种表现出相似的热极限，那么这些相似性可能是进化历史的产物，而不是局部适应的结果。为了探讨本研究中系统发生假重复（phylogenetic pseudoreplication）的任何潜在影响，我们测试了与地理来源（海拔梯度）、海拔分布（生命区）和热极限(平均CTmax)相关的系统发生信号。我们使用贝叶斯推理方法组装了一个系统发生树。我们使用Blomberg的K方法(package Picante,Program R 3.0.2)检测了系统发生信号的存在。我们在地理分布中发现了系统发生的过度分散。近缘类群往往存在于不同的山脉中(K = 0.13, P PIC.variance = 0.01)。我们在卷叶甲虫沿着海拔梯度的海拔分布中，没有检测到系统发生信号(K = 0.03, P PIC. variance = 0.7)。我们检测到CTmax的系统发生的不均匀分布(We detected phylogenetic overdispersion in CTmax.)。密切相关的类群往往显示不同的CTmax值(K =0.11, P PIC.variance = 0.01)。这些结果表明，系统发生的假重复对本研究的结果没有影响。

图 1、对卷叶甲虫的地理分布（海拔梯度）、海拔分布（生命区）和温度上限(CTmax)的系统发生信号进行检测。利用co1序列推断了居群、单倍型和甲虫种之间的系统发生关系。节点值表示后验概率。地理起源、海拔分布和每个分支的平均CTmax在尖端附近的表中表示。没有证据表明系统发生的假重复影响了我们的分析。我们在地理分布和热上限(CTmax)上检测到了系统发生的过度分散。沿海拔梯度的海拔分布没有发现系统发生信号。

植食性昆虫沿海拔梯度的隐存种多样性：

DNA条形码CO1除了鉴定出所有明显形态不同的卷叶甲虫类群，且准确率为100%外，还识别出了几个隐存种。我们还检测到了代表6个植食性昆虫物种的16个种群的第二个DNA条形码间隙。在这些情况下，单倍型之间的差异在90%到95%之间。这些情况可能代表了种群分化或早期物种形成的事件。保守地说，我们认为这些支系代表了同一物种内不同的CO1单倍型。根据来自42个物种和单倍型的1184个CO1 DNA序列，沿两个海拔梯度收集的54个种群，我们共发现了11种物种复合体（species complexes）。在本研究中，超过50%的类群是隐存种/单倍型复合体的一部分。当同一分类复合体（taxonomic complex）内的隐存分类群（cryptic taxa）出现在不同的生命区时，高海拔分类群的CTmax值低于低海拔分类群。

图 2、两个海拔梯度上的卷叶甲虫的种类和单倍型分布

图 3 、Barva（北部）和Talamanca（南部）海拔梯度（A-K）上的卷叶甲虫单倍型和隐存种复合体。

在更温暖的地理来源上，植食性昆虫的CTmax较高：

当比较Talamanca和Barva样带等效生活区植食性昆虫的CTmax时，正如热耐受性假说预测的，在更温暖的Talamanca梯度上，植食性昆虫的CTmax总是较高(F_{elevational gradient} = 89.3, df = 1, P > 0.001;F_{life zone} = 712.1, df = 2, P > 0.001)。Talamanca地区lowland昆虫的CTmax平均比Barva样带高1.7°C (mean ± SDBarva =42.7 ± 1.1 °C, mean ± SDTalamanca = 44.4 ± 0.77 °C)。Talamanca样带premontane植食性昆虫的CTmax比Barva样带同一生活区昆虫的CTmax高2.3°C (mean ± SDBarva =39.2 ± 1.3 °C, mean ± SDTalamanca = 41.5 ± 1.09 °C)。居住在Talamanca样带premontane的植食性昆虫动物的平均CTmax比Barva样带同一生活区的植食性昆虫高1.5°C (mean ± SDBarva = 37.3 ±1.8 °C, mean ± SDTalamanca = 38.8 ± 1.7 °C)。

海拔分布狭窄的植食性昆虫的CTmax随着海拔的升高而降低：

正如热耐受性假说所预测的那样，仅存在于一个生命区( the CTmax of insect herbivore taxa present at only one life zone decreases with increasing elevation)（这里的生命区指的是一个纬度带内，作者将每个样带分为三个纬度带，即lowland or premontane or montane）内的植食性昆虫类群的CTmax随着海拔升高而降低。在这两个海拔梯度上，lowland中的食草动物的CTmax均最高。premontane中物种的CTmax值均低于lowland类群，然而CTmax值最低的物种仅出现在各梯度的最高海拔处，即premontane中(F20,2 =64.6, 513.1, Plife zone < 0.0001, Pspecies < 0.0001)。

以单一单倍型为代表的植食性昆虫的CTmax在多个生命区域随海拔升高保持不变：

一般来说，当以单一单倍型为代表的甲虫物种沿着一个梯度出现在多个生命区时，CTmax在该物种海拔范围内的所有种群中保持不变。这种模式是种群间更高的基因流动的潜在结果。我们只发现了这个模式的一个例外。虽然叶甲科同属物种群（Cephaloleia congener）以一个广泛分布的单倍型为代表，但Barva和Talamanca海拔梯度上的高海拔叶甲科同属物种群的CTmax值比低地种群低1.3°C和3.9°C。这个物种可能有一个独特的热极限的遗传差异（可能Cephaloleia congener种群对热极限不敏感）。然而，我们怀疑这种模式可能代表了一种特殊的情况，即DNA条形码不能区分单倍型。因为与低地种群相比，高海拔种群表现出一些独特的形态特征。

以多种单倍型为代表的植食性昆虫的CTmax随海拔梯度的升高而降低：

对于在不同海拔地区以多种CO1单倍型为代表的甲虫物种，高海拔单倍型的CTmax值低于低地种群。高海拔甲虫单倍型的特点是低热耐受限度；这一模式支持了沿海拔梯度的种群是局部适应的基因型的假设。

图4、卷叶甲虫类群的CTmax(平均±SD，最小-最大值)。Barva（北部）(A)和Talamanca（南）(B)海拔梯度。方框下面的数字代表了样本的大小。条形图上的字母分为类似的类别。

图表 5、以一个或多个单倍型为代表的卷叶甲虫物种的CTmax (A–L; mean ± SD, minimum–maximum)。方框下面的数字代表了样本的大小。

六、讨论

研究结果支持了一种假说，即在变温动物野生种群中，对高温的耐受性具有有限的表型可塑性。正如热耐受性假说所预测的一样，海拔梯度越温暖，昆虫种群的CTmax越高，且CTmax随着海拔高度的升高而降低。生物因素和行为可能会导致环境温度和生物体的热极限之间的不匹配。然而，我们的研究结果表明：这种差异也可能是结合使用非标准化方法的研究数据、对昆虫海拔分布的零散知识和有限的分类分辨率的人为结果。这三个因素极大地降低了综合研究在精细的地理和分类学尺度上寻找模式的可靠性。

本研究还说明了准确的物种划分对了解昆虫的热极限的重要性。传统的形态分类方法认为：本研究中包含的每个隐存种复合体都是一个广泛分布的物种。如果没有DNA条形码提供的洞察，我们就会错误地得出结论，认为CTmax是一种随着海拔升高而变化的特征。我们的结果显示了一个相反的情况：对每一个物种和单倍型来说，CTmax显然是一个固定的特征。预计在下个世纪温度升高3-6°C后，沿Barva和Talamanca梯度的等温线将上升600米。因此，位于最高海拔的昆虫种群随着它们热栖息地的消失也面临着最高的灭绝风险。

一个关键的问题是，CTmax性状是否显示出应对全球变暖所需的进化能力。有证据表明：变温动物可以迅速适应和适应低温。然而，适应更高温度似乎更具挑战性。例如，仅仅过了几代，海角蜥蜴和棘鱼就能够适应更寒冷的环境，但不能适应更温暖的环境。在生态时间内也可以适应较温暖的温度；有证据表明，无尾猿和蜥蜴对温暖温度的热耐受性也能够迅速进化。适应新温度的能力对于高海拔植食性昆虫尤为重要，因为它们对高温的耐受性最低。

进一步研究昆虫适应新条件的潜力，对于理解全球变暖对昆虫沿海拔梯度分布的种群持续存在的复杂影响至关重要。栖息地的丧失和热限制限制了温暖环境的定植，是昆虫在预计的全球变暖环境下将面临的两个主要挑战。

收获：

这篇文章总体来说是一种统计分析的过程，其难点在于数据的收集。将大量样本在不同海拔，不同温度环境下进行CTmax的对比，说明海拔、昆虫生存环境的温度对昆虫的CTmax的影响。其中还构建系统发生树，检验系统发生信号，以排除系统发生假重复的干扰，对不同类群的CTmax进行完全交叉分析，排除其性别，体长的影响。在全球变暖的大背景下，昆虫的CTmax又直接影响其生存，展示了此研究的必要性。这篇文章的优势：第一使用了DNA barcode CO1鉴定隐存种，将原来的形态种详细划分，将一些形态广布种的分布划分为几个分布狭窄的分子种，提高了文章的可信度。第二建立了一种测量卷叶甲虫CTmax的方法，为测量所有卷叶甲虫的CTmax做了大量的的工作，工作量极大。

species complex ：the term 'species complex' may be used in taxonomy as a way of saying a) we think that this group of organisms may represent more than one species; b) we cannot discern the species boundaries with certainty (e.g., due to morphological similarity, or simply insufficient data); and c) we speculate (or assume) that these 'species' are related in some way (not necessarily through phylogenetic relationships which may know nothing about). This operational definition would stand as long as statements a, b), and c) conform with our knowledge. Neither of these points should be assumed to be correct or set in stone, but it may be a convenient way to point out a potentially problematic area. 

Borisenko, Alex. (2016). Re: What is a species complex?. Retrieved from: https://www.researchgate.net/post/What-is-a-species-complex/576d915f404854ce7123321a/citation/download.

haplotype ：A haplotype is a group of genes within an organism that was inherited together from a single parent. The word "haplotype" is derived from the word "haploid," which describes cells with only one set of chromosomes, and from the word "genotype," which refers to the genetic makeup of an organism. A haplotype can describe a pair of genes inherited together from one parent on one chromosome, or it can describe all of the genes on a chromosome that were inherited together from a single parent. This group of genes was inherited together because of genetic linkage, or the phenomenon by which genes that are close to each other on the same chromosome are often inherited together. In addition, the term "haplotype" can also refer to the inheritance of a cluster of single nucleotide polymorphisms (SNPs), which are variations at single positions in the DNA sequence among individuals.

https://www.nature.com/scitable/definition/haplotype-haplotypes-142/

phylogenetic pseudoreplication：A major issue when working with cross-species data is that phylogenetic pseudoreplication may be caused by the presence of phylogenetic signal in the data (i.e ., the degree of similarity in trait values between species due to their common ancestry).

Hylton, A., Chiari, Y., Capellini, I., Barron, M.G. and Glaberman, S. (2018), Mixed phylogenetic signal in fish toxicity data across chemical classes. Ecol Appl, 28: 605-611. https://doi.org/10.1002/eap.1698

注：所用图版和观点，均来自于原文期刊网站。