《爱求索》·探索表观遗传学靶点——EZH2/EED

题记

时常会考虑到一个问题：人的存在，是为了大脑，还是心脏？

虽说项目中经常研究靶点问题，可是面对复杂细胞构造，还是觉得其中机理过于神奇。如果把问题简单看，细胞的核心，应该在细胞核之中。那么细胞的存在，是否又是为了保持相对完整的基因组呢？感觉自己又回到了上学时代，每次看到氨基酸对应的密码子都觉得太神奇，就会想到《创世纪的第八天》中提到的DNA反向双螺旋结构的发现过程——反向、双螺旋、碱基互补，觉得很美！如果有这样一个模型，我想应该摆放在办公桌上，时而让人思考一些基本问题。

DNA常驻核中，时而沉睡，时而清醒；时而松弛，时而紧张。最近在做过一个POLQ相关的TMEJ实验，我们合成了一个线性的DNA，包括启动子+报告蛋白+转录终止子，结果显示转染后2小时，就有很多蛋白已经被编码出来。这表明细胞核中的转录、mRNA出核、核糖体翻译蛋白的过程，可以很快，效率很高，这和《三体》中的世界很像，也可能像分子反应一样，即有合适的原料（蛋白，mRNA， DNA）、合适的条件（时间、空间、结构），就会产生一定的产物（转录、翻译、复制）。

能进入细胞核的成员，是否都是关键成员？常驻核中的成员，是否不易靶向？

本文简要介绍下EZH2和EED相关药物研发进展，并提供相应解决方案。

支原体细胞中核酸和蛋白的虚拟结构¹

EZH2，enhancer of zeste homolog 2，是Polycomb group (PcG) protein家族成员，PRC2复合物的一个催化亚基，从植物、到蝇虫到人类都高度保守，可通过甲基化组蛋白H3第27位赖氨酸来影响DNA的转录水平，抑制包括200种以上的抑癌基因的表达，主要有HOXC8, HOXA9, MYT1, CDKN2A 和retinoic acid target genes等等。EZH2蛋白常在乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌中高表达²。PRC2全称polycomb repressive complex 2，家族中还有PRC1和PhoRC，主要负责催化H3K27的甲基化(H3K27me1, H3K27me2, and H3K27me3)。

EZH2 status in various cancers³

现在再看这种复合物的功能，觉得很神奇，大家以团队协作的方法，发挥着全新的功能。单独看蛋白自身的结构，功能域并不多。这个不像胞质中蛋白间简单的信号转导，如蛋白互作后容易快速发生磷酸化和去磷酸化，需要将信号快速传递下去，最终反馈到细胞核中。在细胞核中，更容易接触到遗传信息，调控机制也比较复杂。在肩负复制、传递遗传物质的职责外，还需要考虑细胞的应激调控，DNA的活化和去活化的职能部门，是相当辛苦的。PRC2的复合物，由主要5个成员组成（有报道称至少需要4个成员⁴），有催化亚基EZH2 （enhancer of zeste homolog 2），调节亚基EED（embryonic ectoderm development）和SUZ12（suppressor of zeste 12），组蛋白结合蛋白RbAp46/48 (also known as RBBP7/4)，还有结合DNA启动子并抑制其转录的锌指蛋白AEBP2（Adipocyte Enhancer-Binding Protein 2），也有报道显示EED可结合甲基化后的H3K27，根据蛋白自身结构域的特点，大致可以猜想各个蛋白间的配合过程和PRC2对DNA活化的抑制作用。

Possible architecture of the PRC2 complex²

Selected PRC2 inhibitors⁵

其中EED蛋白有报道显示该蛋白可结合三甲基化的组蛋白，抑制DNA的活化，关键位点突变后会使PRC2复合体失去对组蛋白的甲基化能力，如此便引入了一个可变构调节PRC2复合物活性的可能性。⁶关于PRC2和EZH2的研究及药物研发工作已开展多年^7,8，也发现了很多高活性的分子，体现很好的效果，如DZNep，EPZ005687，GSK126，UNC1999，，EI1，GSK343，GSK926，EPZ011989，ZLD10A，，CPI-360和CPI-169等³，还有处于临床阶段的PF-06821497（NCT03460977）CPI-1205 (Lirametostat，NCT02395601)和DS-3201b（Valemetostat）⁹，海和生物的HH2853¹⁰，信诺维的XNW5004、恒瑞的SHR2554等等，还有去年FDA批准上市的EPZ-6438 (Tazemetostat)⁴，足以展示该靶点和通路成药性方面的优势。只是临床中也发现突变耐药的情况，如Y111D，A677G，Y641F/N，Y726F等等^11-13，IGF-1R, PI3K和 MAPK等通路的活化，也会拮抗药物的抑制作用，科学家们也在这条通路上仍在寻找新的靶点。看到2022年AACR的摘要中报道了HH2853与tazemetostat头对头相比的体内、体外的活性数据，显示对EZH1/2有较高的的抑制活性，并且对耐药突变有效果，目前处在临床招募阶段，期待会议后能看到更有优质的数据。

2013年有团队报道破坏EZH2和EED（embryonic ectoderm development）之间的相互作用，可抑制依赖EZH2介导的H3K27的甲基化，进而抑制癌细胞的增殖¹⁴，在某种程度上提供了一些肿瘤选择性的抑制，避免了直接抑制EZH2而导致的一些毒副作用。2017年Novartis团队首次报道了EED抑制剂（EED226）抑制肿瘤的效果^5,15。利用PRC2复合物和H3[21-44, K27Me0]通过HTS方式筛选到先导化合物，通过结构解析发现该化合物的结合会进一步诱导EED的构象变化，并产生更容易靶向的活性口袋（PDB ID: 5GSA）^4,14。直到后来发现活性更好的compound 43（EED226），并且在CDX模型中表现出良好的效果，给药停止后的百余天，肿瘤也未曾复发。结合DMPK实验在溶解度、透膜性、稳定性、吸收、生物利用度等方面的评价，都展示较好的成药性，在选择性和安全性的评价中，都表现了良好的特征，也表面靶向EED的可能性及优势。

除此之外，还有一些EED的抑制剂陆续被报道，如A-395¹⁶（化合物综合特性不好，文中用到了很多常用的筛选方法），MAK683¹⁷，BR001¹⁸，EEDi-5285和EEDi-1056¹⁹，体外CDX模型上也展现了长效的抑瘤作用^19,20。相比之前的化合物而言，EEDi-5285的抑制活性更好，选择性也更好。不完全统计，在临床阶段试验阶段的化合物有如Novartis的MAK683 (NCT02900651) ，Fulcrum Therapeutics的FTX-6058 (NCT04586985)²⁰。

也有团队开始探索靶向EED的PROTAC分子的研发，利用VHL的binder，优化了linker的结构，初步可以看到降解EED2和EZH2，活性虽然较弱，但表现出一定的选择性。

UNC6852 Selectively Degrades PRC2 through proteosome²¹

AstraZeneca的团队报道了靶向EED和EZH2蛋白的PROTAC#1和#2，在蛋白降解和细胞增殖等层面上展示了活性，并且比较了不同孵育时间的结果，也显示了此类表观遗传学相关靶点在体外细胞活性抑制实验中需要较长的时间才能看到活性，文中没有提到更多PK和体内活性的数据²²。针对EZH2的蛋白降解研究应该还处在早期，MS1943展示了部分体内的数据，活性依然很弱²³，四川大学和西南交通大学也有报道降解EZH2的PROTAC分子²⁴。

PROTAC#1和#2的体外活性数据²²

Structures of several EZH2 and EED PROTACs.^4,24

后记

目前关于PRC2/EZH2/EED靶点通路、作用机理、耐药机制、临床分子结构，包括PROTAC方面的探索，路线相对清晰，方法学上也容易解决，无论是蛋白表达纯化、蛋白和小分子直接结合、蛋白和细胞水平抑制蛋白互作、成药性评价、选择性评价等等方面，方法学上已经不是难题，如何加速药物研发进程，这里需要很多小分子结构创新的探索。之前和朋友笑谈，在生物学实验员的眼里，药物研发的限速在药化和化学合成；在药化的同仁眼里，生物测试更像是限速步骤，经常遇到没有合适方法评价化合物的问题，或者方法不够灵敏，无法得到清晰的SAR关系。也经常遇到体内模型不灵敏的问题，没有合适的细胞模型开展耐药性的体内模型。

爱思益普团队（ICE Bioscience）致力于提供Drug discovery bioscience解决方案，无论此类靶点是否做过，技术上有多难，我们团队愿意以项目为导向，与合作伙伴一同解决科研问题，让项目不再受限于生物学的检测方法，此处不仅限于药物研发，也包括基础科研、临床转化。ICE大家庭的同仁希望能真实地支持到国内的科研、创新，在未来五到十年内，希望能参与并支持中国更多独立自主创新的研发项目，是我们一直努力的方向。

关于PRC/EZH2/EED的靶点，ICE也在快速拓宽实验方法，EZH2 methylation，EZH2-EED interaction，EED与H3K27Me3的结合实验、EED-PROTAC-VHL三元复合物实验，以及细胞增殖、EZH2/EED降解、细胞内EED和EZH2的蛋白互作实验等等，欢迎垂询，大家一同解决项目的瓶颈问题，加速中国医药研发进程。

 Reference

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