https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7856810/

本文的目的是建立多靶标甲基化诊断模型，评价血液样本ctDNA的甲基化标记物在结直肠癌早期诊断中的临床价值。

名词解释：

甲基化靶向捕获测序：针对感兴趣的基因组区域设计定制探针，将探针与基因组DNA序列进行杂交，捕获并富集目标基因组DNA，然后进行重亚硫酸盐转化处理和高通量测序。

甲基化区块：由位置相近甲基化变异相关性高的CpG位点构成的DNA区段，用作肿瘤标记物。本文报道从公共数据库（TCGA和GEO）筛选出8090个甲基化区块作为结直肠癌肿瘤标记物。

支持向量机（Support Vector Machine, SVM）：是一类按监督学习方式对数据进行二元分类的广义线性分类器。本文通过甲基化水平模型来区分肿瘤与非肿瘤样本。支持向量机的目的是寻找一个超平面来对样本进行分割，分割的原则是间隔最大化，最终转化为一个凸二次规划问题来求解。甲基化标记物很多时，每个标记物都有一个甲基化水平，要评价样本的总体甲基化水平，通常需要建模，建模的方式有逻辑回归法、随机森林法和支持向量机法等。

五折交叉验证：是利用机器学习建模时测试模型精读的方法。交叉验证的目的是为了得到可靠稳定的模型。在建立PCR 或PLS 模型时，一个很重要的因素是取多少个主成分的问题。用交叉验证校验每个主成分下的PRESS值，选择PRESS值小的主成分数。或PRESS值不再变小时的主成分数。例如5折交叉验证(5-fold cross validation)，将数据集分成5份，轮流将其中4份做训练1份做验证，5次的结果的均值作为对算法精度的估计，一般还需要进行多次5折交叉验证求均值，例如：5次5折交叉验证，以求更精确一点。

一、试验设计与方法

1、试验设计

2、DNA提取与检测方法

3、样本计算

假设甲基化早期检测模型可以将诊断结果（曲线下面积，AUC）从80%提高到90%。在95%置信水平下，估计AUC的边缘误差不超过5%，计算病例组和对照组的最小样本量（结果均为106）。参数设置为：

样本量计算软件http://powerandsamplesize.com/Calculators/Test-1-Proportion/1-Sample-1-Sided

4、数据统计

二、结果分析

2.1 参试群体的特征描述

图1显示，956人参与选拔，742人合格，439人通过年龄条件筛选。439人进一步按照2:1随机分组（训练组和测试组），训练组298人（病例对照各149人），测试组141人（病例67例，对照74例）。

表1、训练数据集与测试数据集的基本特征

表1显示，训练集和测试集样本数之比=2:1，均含I-IV级肿瘤样本。肿瘤与对照之间的年龄和性别均无显著差异。

2.2 ctDNA甲基化标记物的性能表现（训练集与测试集比较）

图2a是训练集结果，图2d是测试集结果。 横轴是不同的样本，纵轴是不同基因靶标。图的颜色是甲基化水平。由此构成一个数据矩阵（样本数X 8090个靶标）。根据样本多个靶标的甲基化水平进行聚类分析，可以将肿瘤样本与对照样本分开。

每个样本可求出一个预测概率，代表与该样本综合的甲基化水平（图2b和2e）。

图2b图2e: 样本的甲基化水平（预测概率值）箱线图

纵轴是样本的甲基化水平预测概率值，横轴是不同肿瘤分期。预测概率值来自支持向量机方法，变量包括8090个肿瘤标记物的甲基化水平。

图2c：训练集ROC分析图，AUC值=94.3%(敏感性89.71%，特异性96.93%）

图2f测试集ROC分析图，AUC=93.4%（敏感性86.57%，特异性97.8%）.

2.3 甲基化模型在未经年龄匹配的群体中的测试性能表现

表2 ctDNA甲基化早筛模型性能分析

在训练集中，特异性为89.3%（83.2–93.7%），敏感性为88.6%（82.4–93.2%）。就不同分期而言，I期患者的敏感性为79.4%（62.1–91.2%），II期患者的敏感性为88.9%（77.3–95.8%），III期患者为91.4%（76.9–98.2%），IV期患者为96.2%（80.3–99.9%）。

在测试集中，特异性为91.9%（83.1–97.0%），敏感性为83.6%（72.5–91.6%）。测试组对I-III期的敏感性为82.5%（70.2–91.3%）。与训练集的结果相似。

在不做年龄匹配的总人群中，阳性率为健康对照组7.8%（5.2–11.2%），良性结直肠疾病30.8%（19.9–43.5%），晚期腺瘤58.3%（27.5–84.7%）。与SEPT9甲基化模型的敏感性（41.2%，34.6–48.1%）相比，本模型具有更高的敏感性（87.0%，81.8–91.2%）（P < 0.001），而且特异性不相上下，即90.1%（85.4–93.7%）对90.6%（86.0–94.1%）。

结论

基于ctDNA的多靶标甲基化面板可望用于结直肠癌早期检测，能否用于筛查有待开展更大群体的前瞻性研究。根据本研究结果，作者正在着手开始泛癌早筛研究。

参考文献

Discovery and validation of methylation signatures in blood-based circulating tumor cell-free DNA in early detection of colorectal carcinoma: a case–control study,Clin Epigenetics. 2021; 13: 26.