编译：微科盟如风，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 5岁以下儿童肠道菌群丰度及组成

我们对之前的研究进行了扩展，增加了儿童的数量（n=471）,并对他们出生后前5年进行追踪，以调查肠道菌群的建立情况。我们对16S rRNA基因的V4区进行测序，对出生第一周（n = 246）)， 4个月（n = 411）， 12个月（n = 397）， 3岁（n = 336）和5岁（n = 288）的样本进行收集（表1）。我们还收集了357位分娩后母亲的肠道菌群样本。我们将结果与瑞典SciLifeLab SCAPIS Wellness Profiling（S3WP）研究中来自瑞典正常成年人（50-64岁）的101份粪便样本进行了比较，确定了1,434个操作分类单元（OUT）。婴幼儿肠道菌群的α多样性随年龄而增加，但在5岁时，其多样性仍然比成年人低（p = 4.6⋅10⁻⁵; 图1A）。由于母亲的肠道菌群并不代表正常成年人的菌群，我们使用S3WP成年菌群进行进一步的分析比较。

表1. 研究人群的描述性数据

图 1. 与成人相比，新生儿至5岁时肠道菌群的发育情况。（A）在新生儿（n = 246），4个月（n = 411），12个月（n = 397）的总队列（n = 471）中以Faith PD度量的Alpha多样性（物种多样性），3岁（n = 336），5岁（n = 288），母亲（n = 357）和瑞典SciLifeLab SCAPIS健康状况分析（S3WP）成人。（B）以35个随机选择的儿童的灰阶（从4M到5Y）测量的α多样性的纵向发展，以Faith的PD表示；时间是线性混合效应模型中的重要因素，p <2.2×10 -16，n = 213。（C）总队列中加权UniFrac度量的降维的第一和第二主坐标（括号中的值表示由主坐标解释的总变异量）。（D）表S1 C中的统计数据显示的年龄组中儿童和成人组的加权UniFrac量度在整个队列中的统计数据。（E）年龄组和S3WP成人之间的加权UniFrac度量。

为了更好地模拟每个儿童体内肠道菌群的纵向发展，我们对213名4个月至5岁的儿童进行了亚分析。结果表明，α多样性随着年龄的增长而显著增加，平均每个月增加3.9±0.1个单位的系统发育多样性（p < 2.2⋅10⁻¹⁶）（图1B）。对所有样品进行的加权UniFrac分析表明，肠道菌群的总体组成在不同年龄段发生了显著变化，类似于随着儿童年龄的增长，成年人菌群的数量也有所增加（图1 C-1E）。然而，在5岁时，儿童肠道菌群的组成与母亲和成年人相比仍然存在显着差异。肠道菌群在4-12个月时变化最大，年龄解释了其总方差的23%，而年龄在12个月至3岁间仅解释了5%，在3-5岁间解释了0.9%（图1 C中的方框图）。因此，与成人相比，4个月和12个月婴儿的微生物区系高度异质，与成人相比差异最大，但3岁和5岁婴儿的肠道菌群与成人更相似（图1 D-1E）。

2 4个月至5岁儿童的肠道动力学和肠道菌群特征

为了进一步表征肠道菌群发育的动力学，我们使用时间进程分析对微生物属的相对丰度进行分类，对213名儿童从4个月到5岁的完整样本进行了分析。该分析确定了发育中的肠道菌群中各属的四个主要轨迹：（1）在4个月时相对丰度最高的属；（2）在12个月时相对丰度最高的属；（3）相对丰度在4到12个月之间迅速增加，并在3年内达到稳定水平的属；（4）属水平在12个月后相对丰度增加，并在3岁和5岁之间持续增加（图2 A）。

图2. 在长达5年的肠道微生物群发育过程中微生物属的丰度情况。（A）使用纵向队列中4个月，12个月，3岁和5岁的混合效应模型估算微生物属的中位丰度（n = 213）。（B–E）（B）第一轨迹，（C）第二轨迹，（D）第三轨迹和（E）第四轨迹的代表性属的示例。从（E）开始，（F）总队列和S3WP队列中的每个时间点，属水平的情况。

3 不同年龄段的群落类型

接下来，我们使用Dirichlet多项混合物（DMM）测试不同年龄儿童的肠道菌群是否按照年龄聚集为不同的群落类型。我们确定了14种群落类型：新生儿样本中共有3种（NB 1,2,3型），4个月时有4种常见类型（4M 1,2,3,4型），从12个月起的样本中共有3种群落类型（12M 1,2,3），在3岁和5岁儿童的样本中常见3种群落类型（Child 1,2,3），在成年人样本中常见1种群落类型（图3 A）。

图3. 肠道菌群通过年龄特定的群落类型而发展。（A）样本在已确定的14个群落类型（y轴）中的分布（n = 471）。（B）区分属（行）的群落类型的相对丰富度的热图，按其所属的轨迹排序。（C）α多样性的箱线图（以Faith的PD度量），分布在14个群落类型之间。（D）具有完整系列样本的队列中群落类型之间的转换（n = 213）。

正如所预料的那样，在每个年龄阶段，一般的群落结构以属为主，并有各自菌群定植和建立的轨迹模式。具体来说，新生儿和4月龄婴儿的群落类型符合轨迹1（图2B），12月龄时群落类型符合轨迹2和3，在3岁和5岁时群落组成同时符合轨迹3和4（图3B）。

与5岁儿童相比，成人群落的属水平菌群丰度较高。正如预期那样，且与图1 A中的数据一致，α多样性最低的群落类型以新生儿为主，α多样性最高的群落类型以成年人为主。在相同年龄组的样本中也观察到了群落类型之间的α多样性差异。进一步的分析发现，α多样性划分的群落类型为12M，其中α多样性最高的群落类型为12M3，其中粪杆菌Faecalibacterium和未分类瘤胃球菌unclassified Ruminococcaceae的丰度较高，该群落类型的瘤胃球菌Ruminococcus gnavus丰度也较低。并且，3岁和5岁儿童的群落类型因普雷沃氏菌Prevotella、双歧杆菌Bifidobacterium和拟杆菌Bacteroides的丰度差异而被区分开。

4 向成年群落发展的肠道菌群

为了进一步研究发育轨迹，我们对完整系列样本（n = 213）的亚队列进行了类似的分析。第12个月的α多样性与5岁时的α多样性呈正相关（Spearman相关，rho = 0.32, p = 1.5⋅10⁻⁶）。12M型儿童群落类型的多样性随时间推移而下降，然而Child 3型儿童群落类型的多样性随时间推移而上升（图3A）。但也有少数儿童在5岁时具有相对不成熟的群落类型，即他们的菌群具有12M型特征的群落类型。这些儿童的部分肠道菌群在3岁时也被划分为12M的群落类型，这表明儿童的肠道菌群发育轨迹中存在个体动态性，但没有菌群随着时间的推移降低其α多样性。从4个月到5岁儿童菌群发育的轨迹中 (图3D)，我们确定了最常见的轨迹。

5 在成人及发育中的肠道中与α多样性相关的细菌

由于我们观察到α多样性与菌群发育成熟密切相关，因此我们接下来研究了在不同年龄阶段，哪些细菌与的α多样性相关。在12M型样本中，与多样性增加相关的几个OTU属于粪杆菌属Faecalibacterium，其他几个属于未分类的梭状芽胞杆菌，且对直肠真杆菌Eubacterium rectale具有高度的辨识度（图4A）。有趣的是，各个年龄段属于瘤胃球菌Ruminococcus gnavus的OTU与α多样性呈负相关，并且随着时间的推移会下降，导致成年人菌群的丰度明显低于5岁儿童（图4 B），我们进一步确定瘤胃球菌Ruminococcus gnavus是儿童和成人中未成熟菌群的标志物。

图4.与低群落丰度相关的OUT在儿童和成人菌群中是一致的，在所有年龄的低多样性群落类型中有所增加。（A）OTUs热图与时间点内群落丰富度显著相关。（B）OTU 2724175在不同年龄的相对丰度。（C）分布在不同年龄群落类型之间的瘤胃球菌（Ruminococcus gnavus）OTU 2724175的相对丰度。（D）在12个月（12M）时，三个增重发育组之间的群落类型分布。（E）三个增重发育组在12个月时具有较低（低，12M1+12M2）的α多样性和较高（高，12M3, Child 1,2,3）的α多样性的群落分布。（F）利用Wilcoxon秩和检验校正错误发现率后，绘制了高组（群落类型12M3，Child1，Child2和Child3）和低组（12M1和12M3）在12M处（n = 376）样本丰度差异显著的L6/属水平热图。

6 肠道菌群与生长发育的关联

我们接着研究了队列中12M的菌群组成如何影响儿童接下来的4年中体重的发展。体重增长慢于预期的儿童（根据12个月至5岁之间的生长参考曲线定义为变化> -0.67标准差分数（SDS））在12个月时，与体重发育正常或较快的儿童相比，群落类型（12M1和12M2）的多样性更低（图4 D和4E，Fischer检验；p = 0.028，比值比1.99，95% CI（1.03-4.04））。多样性较低的菌群结构中（群落类型为12M1和12M2），未分类的瘤胃球菌Ruminococcaceae、粪杆菌属Faecalibacterium和氏菌属Roseburia的相对丰度低于成熟微生物组（图4F），这表明，这些群落是一个更多样化的菌群标记物，它们与正常体重增加有关。

7 影响肠道菌群早期生活方式的因素

我们研究的纵向设计允许调查生命早期因素如何影响5岁时的微生物群。我们和其他人先前已经证明，分娩方式对一岁以下儿童的肠道菌群具有深远的影响。在这里，分娩方式对新生儿和婴儿肠道菌群的组成和群落类型以及在4个月时新生儿群落类型之间的过渡有很大影响（图5 A）。

图5. 分娩方式对肠道菌群的影响可达5年。（A）新生儿（NB）和4M群落类型（n = 227）的出生方式的频率和时间点之间的转换。（B）NB、4M和12M群落类型的出生方式的频率和时间点间的转换（n = 347）。（C）在阴道分娩和剖腹产出生儿童中，在12个月时处于“低”和“高”群落类型的儿童的频率。（D）群落类型为“低”和“高”的儿童在12M时间点的α多样性。（E）根据出生方式在每个时间点测得的以PD衡量的α多样性。（F）5岁时阴道产和剖宫产出生儿童的群落类型频率。

我们观察到了在α多样性较低的群落类型中，4个月和12个月的群落类型之间的出生特异性转换模式和较高的剖宫产率（12M1和12M2）（Fischer的精确检验，p = 0.0005，图5 B-5D）。然而，从4个月时的特定群落类型到12个月时的低多样性群落类型的过渡中，没有显著的过渡性代表，无论是剖宫产出生的孩子（Fischer精确检验，p = 0.65）还是阴道分娩的孩子（Fischer精确检验，p = 0.12；图5 B）。在使用所有样本进行的横断面比较中，剖腹产婴儿的α多样性在4个月时较低，但在3岁时趋于正常，在5岁时甚至更高（图5 F）。因此，5岁儿童“成人”群落类型的数量在剖宫产的儿童中，占到了过多的比例（Fischer’s检验，p = 0.039，图5F)。我们还观察到，在剖宫出生与顺产出生的5岁儿童之间，有25个属的相对丰度存在显著差异。

在本研究中，我们对471名正常瑞典儿童从出生到5岁的肠道菌群的发育进行了描述，以扩展之前的研究，表明肠道菌群在儿童5岁时具有成年人样的结构，但其丰富度仍然较低，并且遗漏了一些存在于成人肠道中的关键菌群。我们的研究结果强调了一种可能性，即菌群可能对早期建立过程中的干扰因素特别敏感，这可能会对以后的健康产生深远的影响。

我们观察到了3岁以下每个时间点的特定年龄菌群类型，从而证实了在生命最初几年肠道菌群的显著发展。在儿童开始吃固体食物的时候，更复杂的微生物群出现了，与其有关的菌群在成人中很常见，被定义为轨迹3。断奶后，产甲烷菌Methanogens（如甲烷短杆菌Methanobrevibacter）的丰度首先增加（Maczulak et al., 1989），这与我们的发现相一致。此外，甲烷短杆菌属Methanobrevibacter和脱硫弧菌属Desulfovibrio是氢的消耗者，并按照轨迹4定植，这可能通过减少抑制发酵过程的氢量来增强发酵潜力。

正如之前在3岁儿童和学龄儿童中观察到的那样，我们确定了3岁和5岁时群落类型的差异性在拟杆菌Bacteroides、普雷沃氏菌Prevotella和双歧杆菌Bifidobacterium中。然而，通过将成年人纳入我们的聚类分析，我们不仅发现了少数5岁儿童与成年人聚类，表明其肠道菌群相对于他们的年龄更成熟，而且一些成年人的菌群比他们年龄预期的更不成熟。不同细菌的OTUs与12个月、3岁、5岁和成人时的α多样性相关。高α多样性与几种未指定的梭状芽胞杆菌目Clostridiales、甲烷短杆菌Methanobrevibacter, 克里斯滕森菌科Christensenellaceae有关，以及在儿童和成人微生物区系中R. gnavus丰度较低，这与随着时间的推移，R. gnavus的丰度降低的结论是一致的。

与营养不良的儿童相比，营养不良儿童的微生物群是不成熟的。我们并未纳入临床营养不良的孩子在我们的研究中，但可以观察到，在12个月到5岁之间体重增加低于预期的儿童在12个月时肠道微生物群更不成熟，尽管比马拉维和孟加拉国的临床营养不良儿童要明显得多。然而，与营养不良的儿童类似，体重增加较低的瑞典儿童粪杆菌属Faecalibacterium和瘤胃球菌Ruminococcus类群的丰度降低。重要的是，由于我们的结果是基于相对丰度的，我们不能排除特定类群丰度的明显增加或减少可能是由于儿童粪便样本中总细菌负荷变化的因素。

关于分娩方式对出生后第一年的肠道微生物组成的影响已有大量文献报道。此外，分娩方式也可能与变态反应和肥胖症的发生有关，这可能是通过影响出生后免疫系统发育过程中关键窗口的微生物群而导致的。与此一致的是，我们在已发表的文献中发现，分娩方式对生命早期的肠道菌群有很大的影响，尽管它仍然可以显著解释3岁和5岁时肠道菌群的组成变化，但这种影响很小。剖宫产与4个月时α多样性较低相关，这与之前的观察结果一致。我们还观察到，在剖宫产儿童处于菌群过渡阶段时，即年龄为12个月时，其α多样性较低且在该类型中处于多数。然而，这些差异随着肠道菌群的持续成熟而正常化。未来，当肠道菌群可能对疾病的发展特别敏感时，需要进行更大规模的研究来确定潜在的发育窗口。此外，利用扩增子序列变异对先前发表的数据集进行再分析和荟萃分析，可能有助于独立于参考数据库的重要类群的识别。

在本研究中，我们使用一个纵向出生队列来描述生命前5年人类肠道菌群的发育情况。我们得出的结论是，一些与人类健康有关的菌群类型是在童年晚期获得的，并且在5岁时还没有达到成年人肠道的水平。此外，我们观察到正常人群中儿童的肠道菌群沿着菌群的发展轨迹以个体的速度发育，因此强调了考虑菌群动力学的重要性。

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