编译：傻狍子，编辑：木木夕、江舜尧。

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本次实验于2014年10月在芬兰东北部伊萨克卡的库莫进行，该森林以挪威云杉为主。在不同云杉原木上采集孢子囊进行实验，共收集了176个孢子囊。我们通过去除外表层以避免空气污染并处理亚菌落层，从菌丝层切下10到15个小块，每个小块是5 mm³，将其放入包含800 μl 2％CTAB和1％β-巯基乙醇的2 mL EP管中，并保存在-20°C并进行DNA提取及文库构建并进行测序。使用BAYESHAMMER软件纠正了包括替换和插入缺失在内的测序错误。使用PEAR合并得到的25,935,562个读段，最小序列长度为200 bp，并使用Fastx-toolkit和VSEARCH按质量和长度进行过滤。使用VSEARCH对ITS2序列进行重复复制和丰度排序。由于我们希望将分析限制在最丰富的真菌上，因此单例被排除在外，仅保留数据集中总观察计数>10个序列支持的OTU。在QIIME中使用BLAST相对于NCBI和UNITE数据库来分配ITS2代表序列的分类。原始OTU表包括组装成2188个OTU的16,196,863个读段。为了纠正由于例如PCR和测序错误导致的OTU过度分裂，我们使用LULU算法处理了原始OTU表，并保留了1632个OTU。在通过DCA检查可重复性之后，我们从数据集中删除了12个PCR重复样本。最终的已过滤OTU表由1794,144个读取，1367个OTU组成。然后，我们在R包VEGAN中使用了rrarefy函数，以使样本之间的丰度可比（10,000个读数/样本），并排除了两个样本（fompin3和fompin4）。病原真菌宿主的特征是可测量的性状随物种而变化。从文献中汇编了一系列这些性状变量，在森林规模上推断丰度数据，并将其记录为重点物种的原木数量（局部丰度）。最后，比例从当前数据集中估计每个样品中真菌寄生菌读取的数量，并将其推断为响应变量。

为了估计采样工作量是否达到可接受的效率水平，我们使用VEGAN中的功能谱和稀疏方法为11个真菌宿主构建了物种积累曲线。使用OTU丰富度和Shannon指数评估果皮相关性状的影响，并结合到VEGAN中，并使用GGPLOT2软件包进行可视化处理。为了研究孢子囊的寿命和形态对OTU丰富度（对数转化）和Shannon多样性的影响，使用LME4包在R中拟合了线性混合效应模型。并从NCBI中提取了11种真菌的部分28S rRNA序列，在MUSCLE中进行了多序列比对，并基于MEGA中的最大复合似然模型计算了成对距离矩阵。同样，我们计算了来自真菌群落的距离矩阵，对两个矩阵进行了汇总，并对VEGAN中的9999个排列进行了普氏分析，以关联这两个矩阵。为了可视化OTU跨物种的群落组成的变化，我们使用了在VEGAN中实现的非度量多维标度（NMDS），并采用Liu等人^[1]推荐的参数设置。为了确认NMDS的收敛性，使用具有999个排列的普氏分析对两个最佳解决方案进行了比较。由于不可能产生具有可接受的应力值和收敛性的NMDS规范，因此我们通过删除11个样本（小于5个OTU）来减小数据的大小。此外，我们进行了DCA并测试了与NMDS的一致性；结果一致性证明该结果是可靠的。。使用VEGAN中envfit功能，可以观察到孢子囊皮形态、寿命、真菌宿主物种的大小、局部丰度和真菌寄生菌比例的影响。每个变量与NMDS的拟合度（R2）通过999个排列的蒙特卡罗分析进行评估（表1）。为了揭示真菌群落对每个变量的多重反应的详细信息，我们应用了在R-INLA中实现的贝叶斯广义线性建模，其中宿主物种被用作预测真菌寄生菌比例的因素。为了研究当地和区域尺度上宿主物种的丰度对真菌寄生菌丰富度的影响，我们使用PHYLOSEQ估计了另一个α指数Chao1，该指数解释了数据集中低丰度的罕见OTU。为了确定宿主真菌的重要共生模式，我们使用R包Indicspecies执行了指标物种分析。首先，我们使用multipatt函数来确定与特定宿主相关的OTU列表;其次，基于置换测试，我们对指标值指数进行了过滤，以仅保留具有至少两个显着关联的（p<0.05）真菌宿主。最后，我们使用Cytoscape可视化11种宿主真菌之间的真菌OTUs相互作用网络。

表1 NMDS轴变量的拟合优度(R²)解释了真菌群落结构的变化。

1. 真菌寄生菌的比例和分类组成

使用元编码方法，我们分析了居住在森林中的11种真菌宿主物种的生活在孢子囊中的真菌的多样性。正如预期的那样，大部分ITS2序列对应于真菌宿主物种，而代表真菌的非宿主ITS2序列的相对丰度范围介于Fomitopsis rosea的2.8％到Amylocystis lapponica的39.8％（图1A）。大部分真菌寄生菌都属于子囊菌，在Phellopilus nigrolimitatus中为77％，而在Antrodia serialis中为96％，其中以Hellotiales和Hypocreales为最丰富（图1B）。然而，在多孔松柏Fomitopsis pinicola中，糖酵母的子囊酵母是高度占优势的，占真菌序列的47％。担子菌属，占真菌读物的6.7％，是第二丰富的门类，以小花纲和烛台为主要目。在八个焦点寄主中以不同比例存在毛霉菌（6.3％），主要表现为Mucorales和Umbelopsidales。除了这些主要的门外，我们还以较低的频率（<1％）检测到了属于Chytridiomycota，Mortierellomycota，Olpidiomycota和Rozellomycota的OTU，这些OTU主要存在于宿主Trichaptum abietinum和Phellinus viticola中。

图1 真菌寄生菌的比例和分类组成。A表示非宿主真菌对应的ITS2序列相对于包括宿主在内的所有真菌序列的比例的条形图。对于每个物种，从16个孢子囊计算平均值，误差条代表95%的置信区间，表明物种间的系统差异。B真菌15个主要目(按字母顺序排列)的平均比例，其中蓝色代表担子菌门，红色代表子囊菌门，绿色代表毛霉菌门。

2. 真菌寄生菌的多样性因宿主真菌生活史的特点而异

真菌宿主物种根据其孢子囊的寿命分为两类：短寿命的（4种，64个个体）和长寿的孢子（7种，110个个体）。在这两个类别之间观察到OTU丰富度有显着差异（图2A），短寿命的孢子囊比长寿的孢子囊平均多容纳2.58个（p = 0.03）。相反，短寿命和长寿命的孢子囊之间的Shannon多样性没有显着差异（p = 0.16，图2C）。在短寿命物种中，产生表面积较大的苏木状孢子囊的T. abietinum（triabi）和P. centrifuga（phecen）显示出特别高的OTU。关于孢子囊形态，我们观察到与桩状的孢子囊相比，复果皮中的OTU丰富度以及Shannon多样性指数更高。具孢子囊的物种在OTU丰富度和Shannon多样性方面的变异性均高于异养物种。为了检验真菌多样性是否与宿主丰度相关，我们在局部和区域尺度上将宿主物种的丰度数据与真菌的OTU丰度、Shannon和Chao1指数进行了相关性分析。结果表明种群规模较小的宿主与真菌多样性较低有关。然而，所有相关性都很弱且不显著。

图2 真菌群落的Alpha多样性。箱形图显示了11种木材腐烂真菌的OTU丰度(A,B)和Shannon多样性(C,D)的变化。对于每一个真菌宿主物种，分析了16个孢子囊。黑点表示数据落在四分位数范围之外，而中间值由黑线表示。较小的框架(左下角)分别比较了长孢果和短生孢果(A, C)和具顶孢果和后旋孢果(B, D)。采用Wilcoxon检验评价不同类别间的统计学差异，p< 0.05。

3. 群落格局的主要驱动力

多变量分析表明，所有评价变量均与成分变化显著相关(表2)。分析表明，不同宿主物种之间的真菌寄生菌群落存在差异。有趣的是，与许多短寿命真菌相比，具有长寿孢子的种类的成分变化更大，这表明短暂的孢子囊具有更多的物种特异性(图3)。总体而言，群落组成结果表明了真菌寄生菌和真菌宿主物种之间的紧密联系。28S rRNA系统发育分析表明，宿主真菌的遗传距离与群落距离呈高度相关(0.68)，但差异不显著(p = 0.19, N = 11)

表2 丰富度分析以寄主为随机因子，截距为对数(平均值)。高斯分布为对数(丰富度)。

图3 基于Bray-Curtis不同相似性矩阵的森林采样11种不同颜色多孔菌的真菌寄生菌群落组成的非度量多维尺度(NMDS)图。椭圆表示样本均值的标准误差，条形表示标准差。表1列出了对约束排序有重要贡献的解释变量。

4. 真菌-真菌共线性分析

图4中所示的相关性说明了真菌寄生菌OTU如何与不同的真菌宿主相关联。在与11种宿主真菌有显著关联（p <0.01）的454种真菌寄生菌OTU中，有236种真菌寄生菌OTU与单个宿主相关，而在至少两种宿主物种（最多11种宿主物种）中共存在218种真菌寄生菌OTU，后者更有可能反映特化种。大多数宿主真菌与真菌寄生菌OTU具有物种特异性的联系，除了玫瑰蔷薇属（Fomitopsis rosea），后者仅与其它真菌宿主共存。相比之下，在四个宿主物种中（Phellopilusnigrolimitatus，Phlebia centrifuga，Phellinus viticola和Trichaptumabietinum），我们检测到大量（30-90）特定于其它宿主的真菌寄生菌。同时，这些物种也与其它宿主共享最多的真菌寄生菌，这表明这四个宿主物种既有特化种，也有泛化种。三名具有短寿命孢子囊的宿主（Amylocystislapponica，Antrodia serialis和Gloeophyllumsepiarium）与中等数量（7–14）的宿主特异性真菌寄生菌OTU相关。

在物种特异性的OTUs中，界级以下未分类学归属的真菌占很大比例，占所有显著共发生的13%。我们可以将具有一定可信度的功能分配给仅确定的一部分OTU。除了已知与植物相关的真菌种类外，我们还检测了动物的真菌病原体，主要来自Leotiomycetes。以前报道的真菌与其它真菌（兼性和专性）相关，形成了与宿主的特异性和普遍性联系。被称为寄生虫的酵母菌(Microbotryomycetes)和银耳菌(Tremellomycetes)纲，在担子菌门中占很大比例，特别是在宿主的P. caesia和G.sepiarium中。一些子囊菌类(如Coleophomaempetri,Hypomyces spp.， tololypocladiumspp，Talaromycesinfraolivaceus)也被报道为真菌的寄生虫存在于许多宿主中。

图4在11个木材腐烂真菌宿主和真菌之间显示454个显著共发生的网络。真菌宿主用填充的正方形符号表示，而圆圈则表示根据种系上色的真菌OTU。特定于单一宿主的236个OTU位于外缘，而两个或两个以上宿主共享的218个OTU位于内缘。所有边缘代表宿主物种和真菌OTU之间的显著链接(999排列检验，p< 0.05)。

这项研究是最早提供基于DNA的各种真菌寄主孢子囊中真菌群落的概述之一。我们在北方森林生态系统中的木腐真菌的孢子囊中揭示了一个真菌的物种特定群落。在数据库中，相当大比例的真菌寄生菌与相关参考序列的关联性很差，表明迄今为止，对于这种真菌寄生菌多样性的研究还很少。我们的研究结果支持真菌寄生菌在真菌界的不同谱系中分布，主要为子囊菌科，并大多数具有未知的生态功能。

1. 短寿命的孢子囊是否更适合真菌寄生菌的生境？

根据我们的第一个假设，我们获得了证据，从OTU的丰富度和Shannon多样性方面来看，短命的孢子囊寄生着更多的真菌，孢子果具有较高水分含量的肉质，海绵状和短暂的孢子囊具有更有利的生态位，促进真菌寄生菌的发芽和生长。我们的另一种假设认为，由于暴露时间较长，长寿命的孢子囊积累了更高的多样性。真菌寄生菌的定殖策略可能代表了对子实体进化过程中被忽略但强大的选择压力，从而导致了真菌寄生菌不同的定殖策略。带有孢子囊的真菌在真菌群落中占主导地位，已经制定了“盛衰”策略，涉及迅速形成孢子，对真菌寄生菌的结构和物理防御投入很少，从而导致衰老。相反的策略是产生复杂且具有抗性的长寿命子孢子，从而限制真菌寄生菌的定殖。然而，生长周期持续数月（例如，P.ferrugineofuscus）至数年（P. nigrolimitatus）的孢子囊寿命有很大差异，这可能部分解释了在这些物种中观察到的真菌寄生菌的OTU丰富度和Shannon多样性的变化。

与产生短生孢子囊的其它宿主物种相比，Amylocystislapponica的α多样性较低。基于气候条件和采样时间的变化（例如深秋）可以直接影响短命物种中真菌的多样性和组成，这可能是导致A.laponica多样性较低的合理原因。有趣的是，我们在A.lapponica中检测到了高度丰富的Hypomyces序列，在宿主孢子囊上也发现了橙色到红色的斑点。Hypomyces是一种分布在世界各地的Pezizomycotina属，包括改变宿主原有颜色和形状的真菌宿主，如Amanita, Agaricus,Lactarius,Russula和Polyporales。在某些特定物种的寄生虫占主导地位的宿主中，例如A.laponica中的Hypomyces，可能由于其它寄生虫的竞争性排斥，导致A.laponica中Hypomyces的α多样性降低。

2. 孢子囊的形态重要吗?

我们发现我们的第二个假设得到了支持，这意味着与松散的物种相比，复生的孢子囊具有更高的真菌寄生菌多样性。复生的孢子囊具有更高的表面积体积比。因此，较大孢子囊的表面积与木质基质接触，形成复生菌种，并暴露于空气和风，降水和（内）脊椎动物中，这是真菌传播的潜在媒介。尽管我们处理了孢子囊的菌丝层，但是我们不能排除这些非宿主真菌的一部分可能仅以孢子或菌丝体碎片的形式存在，而在宿主真菌中却没有真正的生态作用。

3. 真菌寄生菌的物种特异性如何?

如假设，我们观察到宿主真菌和真菌寄生菌之间的物种特定共生的数量相对较高。多变量分析还支持孢子囊真菌的组装过程不是随机进行的，而是由特定物种的过滤过程所控制。实际上，在森林规模和更广阔的景观水平上，特定的地理环境可以通过影响宿主来影响真菌寄生菌。真菌寄生菌的生长及宿主寄生的能力都受到在真菌生长变化的限制范围内的非生物因素方面的局部生境适应性所影响。为了生长，真菌寄生菌必须能够承受宿主真菌的生化防御作用。多孔真菌产生次生代谢产物，包括三萜、有机酸和挥发性有机化合物，以其广泛的生物活性而闻名，如抗菌、抗炎、细胞毒性、抗氧化、免疫增强和抗凝血酶特性。通过对各种次生代谢产物的适应可能导致宿主特异性改变。

4. 宿主的丰度起多大程度上的作用?

岛屿生物地理学理论表明，纯粹由于分散的限制，偏远岛屿的生物多样性少于相连岛屿。同样，如果我们已经看到，如果真菌寄生菌和寄主之间存在物种特异性的联系，那么人们可能会认为，与种群较小的物种相比，具有种群较大的和众多孢子囊的寄主物种将具有更高的真菌丰度。宿主物种的丰度数据使我们能够检验这一假设。但是，我们观察到在任何一个空间尺度上，宿主的丰度与OTU丰富度（所有多样性指数）之间都没有显著的相关性。因此，在驱动真菌多样性方面，宿主丰度以外的其它因素更为重要。因为本实验重点宿主物种被限制在古老的北方森林和在芬兰东北部更丰富的区域，这里检查的宿主物种的数量(n = 11)可能太低，不能对这个结果得出任何有意义的结论。

5. 真菌寄生菌所起的生态作用?

我们揭示了真菌寄生菌的高度多样性，广泛分布在真菌群落的不同谱系中。在描述的真菌寄生菌中，大多数被归类为真菌寄生虫，这可能是基于在自然界或在农业中在蘑菇上观察到的症状。虽然，很容易推测它们具有不同的生态作用，例如真菌寄生虫，死真菌宿主组织的腐生菌甚至是共生者，但根据我们的数据，不可能清楚地确定它们的生活策略。众所周知，许多作为植物内生活的真菌对其寄主具有有益的功能。这些真菌通过直接作用（生长促进剂和次生代谢物的释放）或间接作用（改变宿主生理和营养平衡）来保护其宿主植物。人们可能期望这种有益真菌与宿主真菌共同进化并发展宿主特异性。考虑到某些真菌的寿命相对较短，人们可能会问为什么真菌寄生菌通过这种策略适应寄主？显然，容易定殖和生长以及宿主防御水平低是合理的论据。但是，原因可能更为复杂，因为某些真菌寄生菌可能并不仅仅局限于孢子囊的定殖。例如，某些侵入性坏死病菌也能够穿透宿主细胞壁并在营养菌丝体中生长，就像内共生细菌驻留在真菌菌丝体中一样。在这种情况下，宿主的整个生命周期都是被寄生的。

作者在同一森林中对11种真菌进行了研究，由于其在养分循环中的生态重要性，分布广泛，子果皮特征的多样性以及广泛的次生代谢产物的产生，多孔真菌显然是研究宿主特异性和真菌寄生菌-宿主共进化的理想研究系统。因此，作者进一步了评估这些共生模式(真菌和它们的真菌宿主之间)在更广泛的地理尺度上是否稳定，以及它们在多大程度上也受到场地特征(如气候和森林连通性)的影响。并对孢子囊的寿命、形态、宿主的生态多样性等方面进行了具体的分析。总体而言，作者的发现强调了宿主种类是决定真菌群落组成和多样性的主要因素，并为进一步对真菌寄生菌-宿主共生的研究提供了思路和理论基础。

参考文献：

[1]Liu H, Økland T, Halvorsen R, Gao J, Liu Q, Eilertsen O, et al. Gradientsanalyses of forests ground vegetation and its relationships to environmentalvariables in five subtropical forest areas, S and SW China. Sommerfeltia.2008;32:3-196.

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