文献来源：Association of PTEN Gene Methylation With Genetic Alterations in the Phosphatidylinositol 3-Kinase/AKT Signaling Pathway in Thyroid Tumors，Cancer 2008;113:2440–7. （影响因子6.1）

本研究包括两个部分，第一个部分是基于肿瘤组织样本的试验（收集3种不同阶段组织样本，共143例），主要考察1）甲基化水平与肿瘤进程的关系；2）信号通路中基因变化与甲基化的关系。第二部分是基于培养细胞系的试验，考察信号途径抑制剂对PTEN基因蛋白及RNA表达水平的影响。

1、背景

在甲状腺肿瘤发生和发展过程中PI3K/AKT信号通路发挥着重要作用。该通路因基因改变（特别是PIK3CA基因和Ras基因的改变）而异常激活是甲状腺肿瘤发生的主要原因。另一方面，甲状腺肿瘤的PTEN基因因甲基化而沉默，导致PI3K/AKT通路下调，但PTEN基因与该信号通路的基因改变有何关系仍不清楚。

2、材料与方法

2.1甲状腺细胞系

本研究使用了5种人甲状腺癌细胞系：ATC细胞系Hth7、Hth74和SW1736细胞系最初来自N.E.Heldin博士（瑞典乌普萨拉大学）；ATC细胞系KAT18来自肯尼思.艾因博士（肯塔基大学医学中心，莱克星顿）；FTC细胞系FTC133来自Georg Brabant博士（曼彻斯特大学，英国，曼彻斯特）。这些细胞系用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37⁰C下进行培养。在一些实验中，采用AKT抑制剂IV（EMD Chemicals，Inc.，Gibbstown，NJ）处理细胞。

2.2甲状腺肿瘤DNA

甲状腺肿瘤DNA样本来源于先前的研究，其制备方法如前所述。本研究共分析143例甲状腺肿瘤，包括42个BTA、65个FTC和36个ATC。

2.3亚硫酸氢钠处理

如前所述，从肿瘤组织提取DNA，并用亚硫酸氢钠进行处理。简单地说，取2mg基因组DNA、10 mg鲑鱼精子DNA和0.3 M NaOH，加蒸馏水至最终体积23 mL，在50⁰C下20分钟使DNA变性。随后，将以上混合液放入新制备的500 mL溶液（含3 M亚硫酸氢钠和10 M M对苯二酚的溶液）中在70⁰C下恒温处理3小时。处理后，用Wizard DNA纯化系统（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州）对DNA进行纯化，然后经过乙醇沉淀，真空干燥，DNA溶解在30毫升的水中。亚硫酸氢钠处理后，所有未甲基化的胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶，甲基化残基保持不变。DNA样本经亚硫酸氢钠修饰后在28⁰C温度下保存。

2.4甲基化特异性实时定量PCR分析（QMSP）

实时定量甲基化特异性聚合酶链反应分析（QMSP）如前所述，每一个DNA样品的反应一式三份，总体积为20mL，含有亚硫酸氢钠处理后的基因组DNA3mL，每种引物600 nM，探针200 nM，MgCl₂5.5 mM，钯Taq聚合酶5U，脱氧核苷三磷酸（A，C，G，T）每种各200mM以及2% Rox内参。使用ABI Prism 7900HT 扩增仪（加州福斯特市PerkinElmer）在95⁰C下初始变性2分钟后，在95⁰C下15秒，60⁰C下15秒运行45个循环以便退火和延伸。正常白细胞DNA用甲基化酶SssⅠ进行甲基化处理（新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州）以产生完全甲基化的DNA作为阳性对照。每个板含有三份样品和多个空白水，以及阴性未甲基化对照品和阳性甲基化对照品的连续稀释液，以构建校准曲线。用于PTEN基因的引物和探针如前所述，分别是50-GTT TCG cgtt TGT TGTAAA AGT CG-30（sense）；50-CAA TAT AAC ctaaa CTT ACT CGA ACC-30（反义）；50-6famttcca ACC GCC AAC CTA CAC TTATAMRA-30（探针）。RASSF1A基因的引物和探针如前所述，为50-GCG TTG AAG TCG GGG TTC-30（sense）；50-CCC GTA CTT CGC TAA CTT TAA ACG-30（反义）；50-6FAM-ACA AAC GCG AAC CGA ACGAAA CCA-TAMRA-30（probe）。内参照基因β-actin的引物和探针分别为50-TGGTGA-TGG-AGG-AGG-T T T-AGT-AAG-T-30（sense）、50-AAC-CAA-TAA-AAC-CTC-CCT-TAA-30（反义）和50-6FAM-ACC-ACC-ACC-CAA-ACA-AAC-ACA-TAMRA-30（probe）。用前面描述的方法计算每个DNA样本的相对甲基化水平。

2.5 分析PI3K/AKT途径中的遗传改变

PI3K/AKT途径相关的遗传改变包括PIK3CA拷贝数扩增、PIK3CA突变（第9和20外显子）、Ras突变（N2-ras、H2-ras，K1 ras）和PTEN突变（第5、6、7和8外显子）。分析方法如前所述（Hou P, Liu D, Shan Y, et al. Genetic alterations and their relationship in the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway in thyroid cancer. Clin Cancer Res. 2007;13:1161-1170.）

Western印迹分析

为了证实AKT抑制剂对细胞PI3K/AKT信号的抑制作用，我们进行了AKT磷酸化水平的Western blotting分析。在RIPA缓冲液中进行细胞裂解（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）。裂解物在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（10%）凝胶上电泳，然后将电泳产物转膜到聚偏二氟乙烯膜（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ）上，并用特异性一级抗体（抗磷酸AKT（Sc-7985-R）、抗AKT-1/2/3（Sc-8312）和抗肌动蛋白（Sc-1616-R））进行免疫印迹反应（圣克鲁斯生物技术公司）。抗原抗体复合物采用辣根过氧化物酶-结合抗鼠（SC-2005）或抗兔（SC-2004）免疫球蛋白G抗体（圣克鲁斯生物技术）和ECL Western印迹分析系统(Amersham Pharmacia)观察。

统计分析

样本平均数的比较采取方差不等的成组t检验进行。少于4例的数据采取双尾Fisher exact检验进行。

3、技术路线

3．1材料

5种培养细胞系（BTA\ATC\FTC代表肿瘤不同阶段）

3种甲状腺肿瘤组织样本DNA （BTA\ATC\FTC代表肿瘤不同阶段）

3.2 AKT抑制剂IV

3.3 检测指标

l  PTEN/RASSF1A（甲基化水平、蛋白质表达水平）

l  PI3K/AKT通路有无基因改变（+/-）

4、结果

从良性甲状腺腺瘤（BTA）到滤泡性甲状腺癌（FTC），再到侵袭间变性甲状腺癌（ATC），PTEN甲基化水平逐渐升高。另一方面，随着PI3K/AKT信号通路中的基因改变被激活，肿瘤患病率逐渐升高。PTEN基因的甲基化与整体基因改变和个体基因变异均有关系，特别是PIK3CA和Ras基因变异，PI3K/AKT通路在3种甲状腺肿瘤中的表达。相反，肿瘤抑制基因RASSF1A没有这种关系。

结论

在甲状腺肿瘤中，PTEN甲基化与PI3K/AKT通路的基因改变存在着有趣的关联性。与此相适应的模型是：PTEN基因因异常甲基化而沉默，激活了PI3K/AKT通路的基因改变，该通路的信号增强而导致甲状腺肿瘤恶化。

结果与分析

图1. 三种甲状腺肿瘤的甲基化水平（检测方法：甲基化特异性定量PCR检测）

Y轴是相对甲基化水平，计算公式分别为：PTEN/β-actin×1000（A）和 RASSF1A/β-actin×100（B）。图中三组甲状腺组织样本分别是良性甲状腺腺瘤（BTA，42个样本），滤泡性甲状腺癌（FTC，65例）和间变性甲状腺癌（ATC，36例）。红色横杠表示每组的平均值。**表示差异极显著（P<0.01）。

图2. PTEN（A）与RASSF1A（B）高甲基化与PI3K/AKT途径遗传改变的关系

PI3K/AKT途径中的遗传改变与PTEN (A) 和 RASSF1A (B)两个基因发生高甲基化的关系。纵坐标表示两个基因的甲基化水平。-号表示在PI3K/AKT途径中缺乏遗传改变；+号表示在PI3K/AKT途径中存在遗传改变。ATC=间变性甲状腺癌；BTA=良性甲状腺腺瘤；FTC=滤泡状甲状腺癌症。红色横条表示每组的平均值。*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。

表1

PTEN高甲基化与甲状腺肿瘤PI3K/AKT途径遗传总变化的关系

BTA表示良性甲状腺腺瘤；FTC，滤泡性甲状腺癌；ATC，间变性甲状腺癌症

图3. 每个甲状腺肿瘤病例中PI3K/AKT路径相关基因改变的分布

Y轴代表PTEN基因的甲基化水平，如图1所示。每个圆圈对应于一个甲状腺肿瘤病例。实心圆代表PI3K/AKT通路上有遗传改变的病例，空心圆代表没有遗传改变的病例。虚线表示甲基化水平为10。ATC 代表间变性甲状腺癌；BTA代表良性甲状腺腺瘤；FTC代表滤泡状甲状腺癌症。

表2

甲状腺肿瘤中PTEN高甲基化与PIK3CA改变（扩增和突变）或Ras突变的关系

BTA=良性甲状腺腺瘤；FTC=滤泡性甲状腺癌；ATC=间变性甲状腺癌。

图4. PTEN甲基化与遗传改变的关系

图4显示PTEN甲基化与甲状腺肿瘤PI3K/AKT通路中单个基因的遗传改变的关系。纵轴表示相对甲基化水平。良性甲状腺腺瘤（BTA）（A）和滤泡甲状腺癌（FTC）（B）。主要的遗传改变包括PIK3CA扩增和突变（称为“PIK3CA改变”）和Ras突变。对于间变性甲状腺癌（ATC）（C），PIK3CA改变是主要的遗传因素事件。红色短横线表示平均值。虚线表示甲基化水平为10。N代表无遗传改变；P代表PIK3CA改变；R代表Ras突变。与没有遗传改变的组相比，*表示差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

图5. 甲状腺癌细胞中 PI3K/AKT途径的抑制作用对PTEN基因甲基化状态的影响

（A）Western blotting分析：5种甲状腺癌细胞系分别用AKT抑制剂（每日2 mM）处理4天，以不处理的为对照，测定PI3K/AKT信号途径的信号。方法是用总AKT（t-AKT）和β-actin作为蛋白质定量对照，用磷酸化AKT（p-AKT）特异性抗体进行杂交。

（B）甲基化特异性PCR：从细胞中提取基因组DNA，经过亚硫酸盐处理后用于PTEN基因甲基化分析。*表示差异显著（P<0.05）。

Hou P, Liu D, Shan Y, et al. Genetic alterations and their relationship in the phosphatidylinositol 3-kinase/AKT pathway in thyroid cancer. Clin Cancer Res. 2007;13:1161-1170.