微生物研究领域在过去的几十年里发展迅速，已经成为一个重大的科学和公众利益的话题。然而我们对“微生物组”一词缺乏一个公认的明确定义。

近日，奥地利格莱兹科技大学Gabriele Berg教授和亥姆霍兹慕尼黑中心Schloter教授究国际专家组成的小组会议讨论关于微生物和微生物组到最新的技术发展和研究结果，明确区分了“微生物群”和“微生物组”两个术语，并就微生物群的组成、微生物群在时间和空间上的异质性和动态性、微生物网络的稳定性和恢复力、核心微生物群的定义进行了全面的讨论，以及功能相关的关键物种以及微生物宿主和微生物群落内物种间相互作用的共同进化原理。

这些宽泛的定义以及所建议的统一概念将有助于今后改进微生物组研究的标准化，并可能成为综合评估数据的起点，从而使知识从基础科学更快地转移到实践中。此外，微生物组标准对于解决与地球健康领域人为驱动的变化相关的新挑战非常重要，对微生物组的理解可能会起到关键作用。

本文是基于2019年3月6日在奥地利图尔恩举行的研讨会的讨论而形成的，该研讨会是Microbiome Support项目的一部分，该项目旨在建立国际研究标准。

研讨会汇集了来自学术，政府和行业团体的领先微生物组研究人员，他们代表了不同领域的专业知识。 在研讨会之前，通过发送在线调查问卷，收集了来自世界100多位专家的建议。调查的结果和随后的研讨会讨论构成了术语“微生物组”的拟议定义的基础，此处介绍了包含微生物组研究规则和基准修订。

01

从微生物到微生物群落的历史

许多技术发明推动了微生物的研究，导致我们对健康和疾病的理解发生了范式转变。

图1 历史回顾

显微镜的发明，让我们得以发现一个全新的未知的微生物世界。

罗伯特·科赫（Robert Koch）对由于微生物感染而导致的人类和动物疾病起源的解释以及病原性概念的发展是微生物学的重要里程碑。

DNA的发现，测序技术，PCR和克隆技术的发展使人们能够使用与培养无关，而是基于DNA和RNA的方法研究微生物群落。

这些新的可能性彻底改变了微生物生态学，因为以高通量的方式进行基因组和宏基因组分析提供了有效的方法来解决单个微生物以及整个自然栖息地中整个群落的功能潜能。

多项综述已强调了结合多种“组学”技术分析宿主微生物相互作用的巨大潜力和巨大潜力。

02

微生物组定义

通常将微生物群落定义为生活在一起的微生物的集合。更具体地说，微生物群落被定义为多物种集合，其中（微生物）有机体在连续的环境中彼此相互作用。  

微生物组的首次定义

1988年，Whipps及其同事研究了根际微生物的生态学，首次定义了微生物组。他们将“微生物组”描述为“微生物”和“生物组”的组合，并在“具有明确的理化特性的合理定义的栖息地”中将“特征微生物群落”命名为“活动剧场”。

该定义代表了微生物群落定义的实质性进步，因为它定义了具有不同特性和功能的微生物群落及其与环境的相互作用，从而形成了特定的生态位。

微生物组的常用定义

但是，在过去的几十年中，还发布了许多其他的微生物组定义。当前最常引用的定义是Lederberg将生态环境中的微生物群落描述为生物体空间或其他环境中的共栖，共生和致病微生物群落。

Marchesi和Ravel集中在对特定环境下的基因组、微生物(和病毒)基因表达模式和蛋白质组以及生物和非生物条件的定义。所有这些定义暗示着宏观生态学的一般概念可以很容易地应用于微生物-微生物以及微生物与宿主的相互作用。

然而，这些为大型真核生物开发的概念在多大程度上可应用于原核生物，这些原核生物具有不同的生活方式，如休眠，表型变异和水平基因转移以及目前尚不清楚的微型真核生物。这就提出了一个挑战，即要考虑一种全新的微生物组生态学概念生态模型和理论体系，特别是在微生物相互之间以及与宿主生物和非生物环境相互作用的不同层次上。 

许多当前的定义未能捕捉到这种复杂性，并且将术语“微生物组”描述为仅涵盖微生物的基因组（下表）。 例如，Merriam Webster发布平台提出了两种微生物组定义：一种描述宏基因组，另一种是微生物群落，但仍然无法将宿主和环境作为微生物组的整体生态成分而不是一个独立的实体来捕获。 

表1 微生物组的定义

修订后的概念框架将使我们能够从对微生物分类的方法转变为更全面的微生物功能及其与环境相互作用的观点。

然而，这将需要跨不同领域工作的科学家之间更多的跨学科互动。关于微生物组的各种观点是Microbiome Support研讨会中讨论的中心部分。

根据在线调查和研讨会讨论中获得的答复，参与者得出的结论是Whipps等人的原始定义仍然是最全面的，它描述了微生物组的复杂性及其生态学和进化生物学的各个方面。 研讨会的参与者讨论了许多关键点，并提出了一些建议，以澄清和修正原始的Whipps和同事的定义。

这些修正案涉及（1）微生物组的成员，（2）微生物组的成员之间以及现有微生物网络内部的相互作用，（3）环境中微生物群落的时空特征，（4）核心微生物群，（5）从功能预测到物种表型，以及（6）微生物组-宿主或环境相互作用和协同进化。 下面将详细讨论这些方面。

03

微生物组成员

微生物群包括形成微生物组的所有活的成员。 下表解释了这两个词源的词源学和差异。细菌，古细菌，真菌，藻类和小的原生生物应被视为微生物组的成员。大多数微生物组研究人员都同意这一定义。  

表2  微生物组/微生物群词源

噬菌体，病毒，质粒和移动遗传元件的整合是微生物组定义中最具争议的问题之一。 参与者在“微生物组定义”在线调查中的评论也证实了这一点。 受访者对病毒和噬菌体是否应属于微生物组这一问题的回答没有给出明确的答案，并且从“无论如何”延伸到“绝对没有”。 

关于来源于死细胞的细胞外DNA（所谓的“遗留DNA”）是否属于微生物组还没有明确的共识。在更广泛的生境分析中，残留DNA最多可占土壤中测序DNA的40％，平均占细菌总DNA的33％，在某些样品中最高比例为80％。 

有意思的是，尽管它非常丰富且无处不在，但遗留DNA对分类学和系统发育多样性的估计影响很小。 当使用特定术语时，微生物组和微生物群之间的清晰区分有助于避免有关微生物组成员的争议（下图）。微生物群通常被定义为存在于特定环境中的活微生物的集合。由于噬菌体，病毒，质粒，病毒，类病毒和游离DNA通常不被视为活微生物，因此它们不属于微生物群。

图2  强调微生物组（微生物群落）及其“活动区”组成的示意图

最初由Whipps及其同事提出的微生物组一词不仅包括微生物群落，还包括微生物的“活动区”。后者涉及微生物产生的所有分子，包括其结构元素（核酸、蛋白质、脂类、多糖）、代谢物（信号分子、毒素、有机和无机分子），以及共存宿主产生的并由周围环境条件构成的分子。因此，“微生物组”术语应包括所有可移动的遗传元件，例如噬菌体，病毒，“遗物”和细胞外DNA，但不属于微生物群（上图）。

此外，在这方面，重要的是要考虑方法方面的差异，以区分DNA与活生物体及其环境（请参阅技术标准章节）。术语微生物组有时也与宏基因组混淆。 然而，宏基因组被明确定义为来自微生物群成员的基因组和基因的集合。

微生物组研究有时关注特定微生物群的行为，通常与明确的假设有关或由其明确证明。虽然越来越多的术语如“细菌组”，“古细菌组”，“霉菌组”或“病毒组”在科学文献中开始出现，但这些术语并非指生物群落（一个具有独特的（微生物）集合的区域生态系统，而物理环境往往反映一定的气候和土壤）作为微生物群本身。因此，最好使用原始术语（细菌，古细菌或真菌群落）。 

与可以单独研究的微生物群落相反，微生物组始终由所有成员组成，这些成员彼此相互作用，生活在相同的栖息地，并共同形成其生态位。 

公认的术语“病毒组”衍生自“病毒”和“基因组”，用于描述由一系列与特定生态系统或全生命周期相关的核酸组成的病毒Shotgun基因组。但是，这里也可以将“病毒基因组”作为语义和科学上更好的术语来建议。

每个微生物组成员应以何种分辨率进行研究？

对于真核生物，在大多数情况下，“生殖单位”是一个适当的水平，可以测量生物的动态，尽管物种定义仍在争论中。 

但是，对于原核生物，尚不存在基于繁殖的定义：当前的物种定义基于生物之间的DNA同源性，例如DNA-DNA杂交揭示的“ 70％以上的DNA相似性”或根据Goris及其同事的建议。 与真核生物相似，微生物菌株或生态型是分类和功能的基础。 此处定义的菌株的稳定性是最关键讨论的问题，主要是由于水平基因转移（HGT）的频繁发生。

后者是由诸如质粒，噬菌体和转座子之类的可移动遗传元件从一种菌株转移到另一种菌株而引起的，导致不可避免的基因组变化并严重影响菌株的稳定性。然而，由于微生物菌株之间的本质功能差异，忽略菌株水平可能会导致对数据的误解。

在微生物菌株中定义具有生态意义的种群对于确定其在环境微生物和与宿主相关的微生物群落中的作用很重要。

最近，作为一种解决方案，引入了一种新的衡量最近基因流量的指标，该方法可确定与近亲相邻的，被强基因流不连续性隔开的一致的遗传和生态单位。

04

微生物网络和相互作用

微生物彼此相互作用，这些共生相互作用对微生物组内的微生物适应性，种群动态和功能能力具有不同的影响。这些相互作用可以在相同物种的微生物之间，也可以在不同物种，属，科和生命域之间。 

这些网络中的交互模式可以是积极的（互惠的、协同的或共栖的）、消极的（偏害共栖[包括捕食、寄生、对抗或竞争]）或中性的，即对相互作用物种的功能能力或适应性没有（或没有观察到）影响。

微生物生命策略的概念可以影响相互作用的结果。 例如，争夺相同来源的微生物在不同营养水平争夺相同化合物时也可以从彼此受益。复杂微生物生态系统的稳定性取决于同一底物在不同浓度水平下的营养相互作用。

重要的是要强调指出，到目前为止，人们对自然界中微生物社会适应的研究还不够。在这里，分子标记可以通过支持自然微生物群系中利他主义者和作弊者等理论来提供社会适应的见解。

次生代谢产物在介导复杂的种间相互作用并确保竞争环境中的生存中起着至关重要的作用。群体感应（QC）, 由小分子（如N-酰基高丝氨酸内酯或肽）诱导的细菌诱导细菌控制合作活动，并使它们的表型适应生物环境，从而导致例如细胞间粘附或生物膜形成。

直接种间电子转移（DIET）是大多数厌氧生态系统中交流的重要机制。此外，挥发性化合物还可以作为长距离信使，实现长距离跨界交流。

此外，所谓的“真菌高速公路”是细菌以及水和养分的运输系统，因此可以在构建微生物网络中发挥重要作用。 

尽管有这些例子，但微生物组内的交流和相互作用仍未得到充分研究，将从对所有微生物组成员的代谢相互作用的更多了解中受益。在这里，还原论实验模型和微生物组模型可以帮助鉴定参与复杂相互作用的微生物和分子机制。

细菌的群体行为调控机制

群体效应(Quorum sensing) 是近来日益受到广泛关注的一种细菌群体行为调控机制, 很多细菌有这种能力, 即分泌一种或多种自诱导剂(Autoinducer) ,细菌通过感应这些自诱导剂来判断菌群密度和周围环境变化, 当菌群数达到一定的阀值(quorum , 菌落或集落数) 后, 启动相应一系列基因的调节表达, 以调节菌体的群体行为。

不同类型的细菌具有不同的群体效应调节系统, 很多细菌分泌同一种诱导剂, 以此调控不同种类细菌间的作用行为。群体效应系统在自诱导剂与受体之间存在专一性, 同时又在调节基因和信号传递系统中体现出多样性和复杂性。由于不少人或植物的病原菌的致病机制等受群体效应的调控, 该机制已成为医学等领域的研究热点。

图3 通过微生物共生网络可视化微生物相互作用

生物信息网络和共现分析给出了关于微生物相互作用模式的复杂性的想法，但它们不适合揭示这些相互作用的性质（上图b）。 尽管存在这一限制，但对微生物网络的分析仍使研究人员能够识别中心物种，并探索微生物组内各种类型的物种相互作用的潜力。在微生物共生网络中，中枢物种以与其他物种的连接程度最高的节点（上图b）为代表。

共现分析也可以在不同的规模上应用，例如，群落规模的生态系统之间的共现模式，群落内共生微生物的模块以及嵌套在微生物群落内的模块内共生对。

它们可以与定植抗性联系起来，这决定了异源微生物入侵本地群落的潜力，并且可以被认为是产生假说的重要工具。 但是，特定类型的微生物相互作用的存在及其对种群动态或功能的后果，需要在相关的模型系统中进行测试（上图c）。

此外，技术方法，如使用稳定同位素的交叉喂养实验或荧光原位杂交和共焦激光扫描显微镜（FISH-CLSM）与双重培养分析相结合，对于检验在硅胶中产生的假设非常有用。

微生物相互作用可能是微生物群落内部进化和共同进化动力学的重要基础

微生物群落成员之间的交流产生了一个复杂的景观，其中细胞的适应性或功能不仅取决于单个细胞的遗传潜能和化学环境，还取决于感测到的生物环境。 网络中的中心物种通常被假设为关键物种，这一概念已从宏观生态学转移到微生物组学研究中。

与其他物种相比，基石物种在各种物种相互作用中起着至关重要的作用，并且对生态系统的性能和动态影响更大。 但是，共同关联网络中的枢纽物种不一定充当基石物种。 后者的特征还必须通过适当的方法加以确认和补充。

枢纽和基石分类单元绝对需要对它们的功能有更好的了解; 此外，它们可以集成到计算方法中以联系微观和宏观生态学问题。 如果可以将关键物种视为“指示分类群”，那么另一个术语（已被定义为高度指示特定实验处理或环境条件的那些类群）仍不清楚。 

指示分类群的概念从实践的角度引起了人们的极大兴趣，并从宏观生态学转移到了微生物组研究中，现在被广泛使用，例如，用于评估农业实践对微生物群落的影响或疾病对微生物的影响的研究。 人类微生物群； 如此处所示，可以使用简单且高度标准化的基于qPCR的方法进行分析。

05

考虑微生物群落的时间和空间变化

微生物群落的时间和空间结构问题对于总体上了解微生物组的功能很重要。对于理解特定过程，例如在生物技术和食品加工应用中病原体的暴发，以及预测和控制微生物群落，它也具有重要意义。总的来说，最初针对大型生物描述的大小多样性关系也被证明存在于各种生态系统中的微生物群落中。

微生物组内的时间动态可以从秒或分钟的尺度进行评估，这反映了信使RNA的时间跨度到几个世纪和一千年的尺度，在此期间微生物与其宿主或在特定环境中共同进化。细菌mRNA的半衰期取决于转录的基因，但通常在数分钟的范围内，而古细菌基因的转录本较长，并且已报道了数小时的时间。

重要的是，尽管过去许多作者将微生物活性与rRNA含量联系在一起，但最近的研究表明该概念存在严重局限性，只有mRNA可被视为代谢状态的可靠指标。 在这一时间尺度范围内理解研究的适当维度对于任何微生物组的操作都是至关重要的，例如在人类微生物组研究中的治疗策略或在环境研究中使用生防制剂。仔细考虑感兴趣宿主的具体特征，例如昼夜节律，季节性变化或与宿主生物的生理学相关的生长阶段，可能有助于确定评估时间动态的最佳尺度。

图4 微生物群在时间和尺度上的动态变化

Stegen等建议考虑三类：（i）生物和非生物历史，（ii）内部动力学，和（iii）外部强迫因素作为影响微生物群落时间动态的因素。

大多数自然生态系统的特征是高度的空间结构，这被认为对许多生态系统服务都很重要。 考虑到空间规模，可能意味着要比较远处区域之间的微生物模式，以及相同生境的生存空间之间的区别不明显（图4b）。 

植物多样性与土壤微生物组多样性的相互影响

土壤主要由微团聚体（<0.25毫米）组成，这些团聚体结合土壤有机碳并保护其免受侵蚀，而大团聚体（0.25到2毫米）则限制了氧气的扩散并调节了水的流量。 每个聚集体都具有独特的生态位，并具有其独特的微生物组结构。 实际上，由于在小空间尺度上存在如此众多的生态位，土壤被认为是地球上微生物群落组成最多样化的生态系统。 例如，农业耕作引起的生态位的减少会导致微生物多样性的丧失。 由于植物和耕作在很大程度上影响土壤结构的发展，植物多样性的丧失也对土壤微生物组的生物多样性产生了强烈影响。 

但是，对于“先生鸡还是蛋”的答案尚不清楚（土壤微生物组的变化会引起植物多样性的改变，反之亦然）。微生物群落对宿主的定殖也不均匀。 

众所周知，例如，叶子的根部与根部相比具有不同的菌群，并且根部本身被微生物异质地定殖，沿着根际的长度以及根部表面与根部内部的微生物群不同。

最近，种子微生物群作为核心微生物群从一代到另一代的垂直传播的一种可能模式引起了人们的关注。

与植物相似，人体也不是被微生物均匀地定殖的：每个人体隔室都包含自己的微生物群，甚至来自一个身体部位的微生物群也可能因采样面积而异（例如皮肤微生物群）。

微生物热点和热点时刻通常紧密相连。例如，土壤的特征是存在所谓的微生物热点（包括根际，小球层或碎屑层在内的空间分离）和热时刻（时间动态）。在热点中，活跃代谢微生物的比例是非热点中微生物的2-20倍，与微生物活性较低的部位相比，热点中微生物组结构和功能的时间变化更具动态性。

06

核心微生物群定义

基于共现分析和捕获微生物群落时空动态的实验数据，研究人员寻求定义核心微生物群落。这确实是有帮助的，因为本地微生物群通常非常复杂，包括来自不同王国的数千种物种。 

定义核心微生物群可以帮助区分微生物群的稳定成员和永久成员，这些种群可能是断断续续的，仅与特定微生物组状态相关或仅限于特定环境条件的种群。

Shade和Handelsman提出了第一个建议，他们将核心微生物组定义为来自相似栖息地的微生物群落之间共享的一组成员，以鉴定复杂微生物群中稳定，一致的成分。

当前，核心微生物群主要是根据具有分类学信息的DNA序列来定义的。考虑到基于DNA的分析（主要是标记基因的扩增子测序）的分辨率极限，但是很明显，核心微生物群主要是通过群体的属级鉴别来定义的，并且菌株特异性和功能变异是不考虑的。

功能性核心微生物群包含携带复制子的媒介

相比之下，Lemanceau及其同事提出了一个功能性核心微生物群，该微生物群包含携带复制子（基因）的微生物媒介，而复制子具有对整体生命的基本功能。 

最近，Toju等人提出了核心微生物群的概念，专门用于将农业生态系统管理为物种丰富的社区； 他们将核心定义为“形成相互作用核心的微生物集，可用于在各个植物和生态系统级别优化微生物功能。”

“核心”微生物群似乎保持相当恒定

Astudillo-García及其同事在审视高度多样化的海洋海绵微生物系统时，评估了不同核心微生物群定义的影响。虽然在定义核心社区时必须谨慎，但是，总体结果似乎对核心定义的变化相对不敏感。瞬时微生物群随时间变化，这取决于环境条件，营养的可获得性和/或宿主的生长和健康阶段，甚至昼夜节律。相反，“核心”微生物群似乎保持相当恒定。就时间动态而言，核心微生物群描述了与给定宿主基因型或特定环境持续相关的微生物群落（图4a）。

这一概念的例外情况也被描述过，例如，在最佳适应再次发生水合/脱水循环的微生物组中，不同的细菌群落在循环中发挥了不同的功能：两者均属于核心。类似地，在空间尺度上，例如，考虑在同一地理区域或同一地理区域的一系列土壤中生长的植物，核心微生物群不变（图4b）。

07

从功能预测到表型

研究微生物组的当前可用方法，即所谓的多组学方法，范围从高通量分离（培养组学）和可视化（显微镜）到靶向分类学组成（宏条形码）或解决代谢潜能（功能基因的宏条形码，宏基因组学） 分析微生物活性（代谢组学，代谢组学，代谢组学）（下图）。 

图5 评估微生物功能的方法

基于宏基因组数据，可以重建微生物基因组。 虽然从环境样品中重建了第一个由基因组组装的基因组，但近年来，数千个细菌基因组在没有培养其背后的生物体的情况下被组合在一起。 例如，最近从9,428个宏基因组中重建了全球154,723个微生物基因组。 

然而，由于一方面微生物基因组DNA序列数据的大量可利用性与另一方面确认基因功能的宏基因组学预测所需的微生物分离物的可利用性之间缺少联系，理解仍然受到很大限制。 

宏基因组数据为新的预测提供了场所，但是需要更多的数据来加强序列与严格的功能预测之间的联系。 考虑到一个氨基酸残基被另一个残基取代可能导致自由基功能改变，从而导致给定基因序列的功能分配不正确，这一点变得显而易见。

此外，需要培养新菌株以帮助鉴定从宏基因组学分析中获得的大部分未知序列，对于研究不足的生态系统，这些序列可能超过70％。根据应用方法的不同，即使在经过充分研究的微生物组中，完全测序的微生物基因组中有40-70%的注释基因没有已知或可预测的功能。

另外，目前的估计预测，具有未知功能的域将很快超过已知功能的族。显然需要更经典的微生物学，包括结合使用靶向突变体和微生物生物化学来应对这一挑战。 

从已经发现的具有未知功能的蛋白家族的全面功能表征中获得的好处，远不止于进一步扩展这些家族的列表。尽管长期以来，结合（广泛的）培养和独立于培养的分析相结合的多阶段方法一直是环境和植物微生物学领域的最新技术，但医学微生物学通常并非如此。 近年来，高通量培养组学建立了人类肠道菌群的参考基因组和培养集。

了解原核生物的功能多样性非常具有挑战性

因为目前建立的118种门中有85种迄今尚未描述过单一种。最后，原核门的数量可能达到数百个，而古细菌门的研究最少。这个问题需要通过收集尚未培养的原核生物有意义的分类学和功能信息来解决。纯培养中细菌和古细菌的多样性与通过分子方法检测到的细菌和古细菌的多样性之间的差距日益扩大，这导致人们提议主要根据序列信息为尚未培养的分类单元建立正式的命名法。 

原核生物国际命名法的建议修改

根据这项建议，念珠菌属的概念将扩展到密切相关的基因组序列的组，并按照已建立的细菌命名规则公布其名称。对原核生物国际命名法的建议修改引起了以下方面的关注：

（1）命名法的可靠性和稳定性；

（2）技术和概念上的局限性以及参考基因组的可用性；

（3）计算机功能的信息内容预测；

（4）识别微生物多样性的进化单位。 

这些挑战需要克服，以达到一个有意义的分类学尚未培养的原核生物，目前尚不清楚的表型。 在这种背景下，已经做出了巨大的努力来培养来自不同环境的细菌。

Staley和Konopka在1985年确定了“大平板计数异常”，它描述了一个事实，即90至99.9％的细菌物种无法在标准实验室条件下生长。对于某些微生物栖息地，尤其是那些具有较高养分含量和微生物活性的微生物，如肠道微生物群所述，相对于通过测序检测到的分子种类，培养物中可利用的代表性菌株的比例从35％增长至65％。

来自其他自然栖息地的微生物种群以及微生物组的真核成员也需要类似的进展。微型真核生物，如原生动物、真菌和藻类的成员，通常可以更好地培养和显微镜下研究；然而，它们的系统发育和分类学更复杂，研究较少。有趣的是，来自不同环境的16S和18srRNA基因的无引物测序表明，在微真核生物中，有大量以前未检测到的类群。

同位素探测技术

除了当前使用的计算机模拟比较和培养方法外，还可以使用一组同位素探测技术直接测试复杂微生物群落中的功能假设。这些方法包括DNA，RNA，蛋白质和脂质稳定的同位素探测（SIP）以及FISH显微放射自显影，FISH-NanoSIMS和FISH-Raman显微光谱学，后三种方法仅提供一种细胞分辨率。 

RACS平台无需培养即可研究微生物代谢途径

最近，开发了一种微流体拉曼活化细胞分选（RACS）平台。在最近的一项研究中，Lee和他的同事在存在氘水的情况下，允许小鼠结肠菌群中的细胞代谢未标记的目标化合物（粘蛋白）。随后，使用RACS平台从复杂的微生物组中选出了活跃地代谢粘蛋白的氘标记细胞，并通过单细胞基因组学和培养方法进行了进一步分析。

这种方法允许以一种新型的无栽培方式将微生物的代谢表型与其基因型联系起来，从而使从微生物的潜能到微生物的功能成为可能（图5）。

尽管取得了一些进展，但这种功能分类平台的产量仍然有限，而FISH和生物正交非标准氨基酸标记（BONCAT）等互补的新技术解决方案将有助于微生物组研究中更迫切需要的以表型为中心的研究。

08

宿主微生物共进化

宿主及其相关微生物之间的密切关系引起了宿主及其相关微生物群共同进化的理论。协同进化是沿袭相互适应的谱系。

一个例子是建立早期的陆地植物，这是由共生真菌联合体促进的，这表明植物自从首次出现在土地上以来就已经与微生物共同进化了。

另一个例子是真核生物。 线粒体和质体是真核细胞中的细胞器，来源于内共生细菌，在整个进化过程中，它们完全取决于宿主，反之亦然。 为了促进对微生物群的全面了解，需要考虑宿主微生物的协同进化（下图）。

图6 对微生物-宿主协同进化的理解从“分离”理论转向整体方法

基于微生物与其宿主之间的相互作用，将微生物分为有益的，致病的和中性的，是广泛引用的Lederberg和McCray关于微生物组定义的一部分。

根据他们的解释，拮抗协同进化包括宿主-寄生虫的相互作用，而当积极相互作用占优势时，则存在互助协同进化。这种积极的相互作用可能演变成专性共生，垂直遗传和代谢协作（上图）。

根据致病微生物，有益微生物和中性微生物与宿主之间的相互作用，对致病微生物，有益微生物和中性微生物进行分类可能对微生物宿主相互作用在调节宿主适应性中起核心作用的研究（例如医学研究）有用。 然而，对致病性数据的解释应谨慎。

对条件致病菌的最新研究表明，宿主与微生物的相互作用不仅取决于宿主，还取决于整个微生物组。自然抑制疾病的土壤表明植物和许多土壤传播条件致病菌的情况类似。

此外，在许多环境研究中，可能没有长时间可利用的特定宿主，这使得划分致病菌和有益菌变得无关紧要。

与其研究一种特定微生物与其宿主之间的相互作用，不如考虑基于全环素理论的整体方法（图6）。 按照这种方法，宿主及其微生物组之间的有益相互作用负责维持整体生物的健康，而疾病通常与微生物失调有关。

在失调的背景下，建立了“病原体组”概念（图6），该概念代表了整合在其生物环境中的病原体，并应用于多种病理系统。这种方法表明，微生物多样性是预防植物和人类肠道疾病的关键因素。

尽管进行了众多研究，定义了“健康的微生物群”，但是在未来，平衡和失调之间的界限仍然是一个重大挑战。 

微生物与宿主之间相互作用的另一种有趣解释是所谓的“安娜·卡列尼娜原理” 。声明指出，与列夫·托尔斯泰的格言类似，“所有幸福的家庭看起来都一样； 每个不幸的家庭都会以自己的方式感到不幸。”

与健康的个体相比，菌群失调个体的微生物群落组成差异更大

例如，健康珊瑚的微生物群比患病珊瑚的微生物群更均匀。 同样，最近的一项研究发现，炎症性肠病患者的群落组成和免疫反应的稳定性明显低于健康人。

进化过程和选择压力极大地推动了宿主-微生物的相互作用

因此，区分为人造的，以人为中心的类别可以随时间变化。一个例子是幽门螺杆菌，它是二十世纪初期几乎所有人胃中的优势微生物，在短短100年内几乎消失了。 幽门螺杆菌一方面是消化性溃疡和胃癌的危险因素；另一方面，这种细菌的丢失与儿童时期的哮喘，花粉症或皮肤过敏有关。 

微生物与其预期宿主之间复杂的进化相互作用的另一个例子是病原体的出现，如嗜麦芽单胞菌，这种植物相关起源的细菌与全球人类条件致病菌株没有区别。 总而言之，自然选择被认为有利于塑造群落组成的宿主，从而促进有益的宿主微生物共生，但是许多因素可以使这种动态失衡，从而诱导宿主微生物组内对病原性或拮抗性微生物的选择。

基于计算模型，Lewin-Epstein等人提出，操纵宿主以利他行为行动的微生物可能会受到选择的青睐，并可能在利他主义的广泛发生中发挥作用。

宿主微生物共同进化导致与植物和动物相关的特定微生物群。这种特异性的程度受许多因素影响，并且在系统发生分支之间也有所不同。 对于代表地球上最古老的陆地植物的苔藓而言，其植物特异性异常高。 这种特异性与宿主的地理来源无关，并且从子孢子垂直传递至配子体，反之亦然。 

驯化和育种活动也可以显着影响宿主微生物组

在某些情况下，其程度也超出预期。消失的微生物群系的理论表明，流行的慢性病是由人为微生物群向多样性降低的转变所引起的。考虑到这一点，重要的是重新考虑我们的行为（例如，对家庭环境进行“过度清洁”）并评估作物管理方法（例如育种策略），以避免丧失共同进化的有益宿主微生物相互作用。

09

微生物组研究技术标准

在过去的十年里，面对微生物学领域显著而持续的技术进步，研究界未能为微生物组研究制定一致的标准。这导致了许多缺点，包括缺少实验室间数据交叉比较的可能性，或者在最近的研究中使用“旧”技术生成的数据的实现。

有大量出版物表明DNA提取和加工程序对微生物组的后续分析存在偏差。使用定义的模拟群落一方面可以帮助确定最佳的提取方法，另一方面可以作为内部控制来估计整个工作流程和分析中的可能偏差。

但是，即使将模拟群落实施到分析中也不能解决所有问题，这会给从环境样本中进行微生物群落的分子分析带来偏差。 例如，不能通过将模拟群落应用于土壤来反映土壤微生物对土壤颗粒的自然吸附过程。

此外，在复杂的栖息地（例如土壤）中，多达80％的提取DNA可能包含遗物DNA（死细胞的细胞外DNA以及活细胞的分泌DNA）。这种残留的DNA可能会增加观察到的原核和真菌的多样性，并导致对分类单元相对丰度的估计不准确。

PMA法有效地抑制了革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌死亡细胞中DNA的PCR扩增

Nocker等人提出了一种可能的解决方案使用叠氮溴化丙锭(PMA)的方法，该单叠氮化物仅穿透膜受损的细胞，其中光诱导的叠氮化物基团与DNA共价结合； 这种交联有效地抑制了革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌死亡细胞中DNA的PCR扩增。该方法已成功应用于微生物组研究，尤其是微生物丰度低和活性低的研究，但这还不是标准。

DNA处理中的一个众所周知的例子是通过分析引物组和引物选择和PCR诱导的选择性扩增或大量未知读物。Karst等人开发的无引物rRNA基因测序方法促进了未知微生物多样性的发现。 

作者建议将SSU rRNA分子的poly（A）尾和逆转录与合成的长读测序结合起来。使用这种方法，他们能够以高通量产生高质量，全长的SSU rRNA序列，而没有引物偏倚，并且在他们的研究中观察到了迄今未描述的多样性中的很大一部分。

对获得的序列数据进行生物信息学分析既不是标准化的，也不是明确表达的偏见。为了进行16S rRNA基因序列的数据评估，可以使用免费软件解决方案和完善的论坛，例如Qiime2和Mothur。

操作分类单元（OTU）长时间用于分析高通量条形码，例如使用标记基因（如16S rRNA和/或ITS区域）获得高通量测序数据。

另外，可以使用基于精确解析的扩增子序列变体（ASV），低至测序基因区域上的单核苷酸差异水平。立即获得更好的分辨率的好处显而易见，ASV作为具有固有生物学意义的一致标签的状态独立于参考数据库而被确定。可重用性，可再现性和全面性方面的改进足够大，以至于ASV可以取代OTU作为标记物基因分析和报告的标准单元。

为了比较不同的工具和管道，已经进行了一些研究和联合项目，结果表明，根据工具或管道以及所使用的设置，结果存在显着差异。显然，除了足够的测序深度之外，用于注释读段的数据库的选择对结果有很大影响。

此外，通常会自动完成的参数选择（例如截止值，嵌合体过滤等）对结果有很大影响。例如，由于数据评估方法仅允许调查代表性超过1％的分类单元，因此经常忽略稀有分类单元。

然而，这种罕见的分类单元最多占所有微生物的28％，可以代表某些生境中的关键角色，并且可能对构建社区具有重要意义。它们在生物地球化学循环中可能起着过比例的作用，并且可能是微生物组功能的隐性驱动因素。而且，携带抗生素抗性基因的微生物通常属于天然微生物群中的稀有分类群。 在压力条件下，它们为健康和生存提供了保障，并确保了生态系统的可塑性。 

但是，在动物和人类肠道微生物组中，这些方面对于疾病暴发和治疗至关重要，因此在WHO对抗生素耐药性扩散的预测中得到了应用。 

同样，在这里，计算资源仍然是使生物信息学成为微生物组分析瓶颈的问题。Ten Hoopen和他的同事描述说，例如，塔拉海洋微生物群项目的一个子集，已经对原核生物进行了尺寸划分，包括135个样本。对于这些样本的分析，需要248次运行，其中包含288亿次读取，分析输出代表大约10 TB的数据。这项广泛的研究产生了232亿个预测的蛋白质编码序列。为了处理如此大的数据，在过去的10年里出现了几个全球微生物组学项目，如人类微生物组群项目和地球微生物组群项目。

此外，宏数据方面的巨大差距，通过阻碍研究的可比性和综合分析，限制了微生物组分析。确实有一些数据存储库，例如序列读取档案SRA（NCBI）、欧洲核苷酸档案（ENA）或CNGB核苷酸序列档案（CNSA）。然而，在许多情况下，数据只“按要求提供”，这与可查找、可访问、可互操作和可重用（公平）原则相矛盾。即使数据是可用的，宏数据往往缺乏重要的信息，并且没有得到包括实验和统计研究设计信息在内的知识库的充分审查。

Schloss和他的同事发表了一篇综合性的综述，关于识别和克服微生物组学研究中再现性、可复制性、稳健性和普遍性的威胁。因此，迫切需要标准化和开发正确和全面的宏数据存储库平台，如Proctor所示，他开发了人类病原体/载体基因组序列的项目和样本应用标准。Ten Hoopen和他的同事描述了一个设计良好的策略，允许制定和应用标准，并根据公平原则从微生物组研究中获得可比较和可重用的数据。

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微生物研究的未来展望与挑战

在经济学技术进步的推动下，微生物组数据的不断增加，使得我们对微生物组群在提高不同系统的生产力和可持续性方面的潜力的理解有了极大的提高。应用微生物研究的宏伟愿景是改善人类、动物、植物和整个生态系统的健康。

一般来说，微生物组可以通过以下方式直接管理：（i）微生物组移植

（ii）具有有益特性的微生物

（iii）微生物群活性代谢物，或通过改变环境条件，使微生物群也将其结构和功能从失调状态转变为健康状态。

在比较人类、动物和种植系统中基于微生物的应用时，可以看到显著的协同作用（下图）。

虽然各个领域还没有很好地联系起来，但所有领域的一致趋势已变得明显。这一趋势涉及到对定制治疗的关注，例如，“下一代”精确农业或个性化药物（下图）。这一概念认识到，并不是所有的个体宿主及其相关的本土微生物群都会以相同的方式对特定的引入微生物、微生物群落移植或代谢物作出反应。

图7 跨领域的微生物组应用趋势

相反，它依赖于对那些特定宿主微生物、环境微生物和微生物相互作用的基本理解，这些微生物在不同的环境中调节微生物组合和功能能力。

Stegen等人在其微生物组管理的概念框架中，建议在不同领域进行更大的串扰，例如，利用环境微生物组学中的特定生态概念来指导优化策略，以操纵人类微生物群，从而改善健康状况。

通过为各种环境和代谢疾病提供有趣的解决方案，人类微生物群正逐渐成为个性化医学的一个关键目标。不仅有助于疾病各个方面的个体差异，也代表了潜在的治疗目标，可通过治疗，饮食变化，使用前，益生元或合生元，与之相对应的生命生物治疗产品来调节物种或物种混合（合成微生物群）和微生物组移植。

植物生物群落路线图

以此类推，植物微生物组被认为是下一次绿色革命（到2030年的科学突破）的关键。结合植物育种，精准农业，农业管理和微生物组研究的系统方法，为在不断变化的世界中改善可持续作物生产提供了强有力的战略。 

跨学科团队将这种方法包含在特定环境中可能影响植物生产的许多生物和地球物理成分，称为“植物生物群落路线图” 。 

特定于物种和栖息地的植物微生物区系对植物整体生物的功能有多个方面，例如（i）种子发芽和生长，（ii）营养供应，（iii）对生物和非生物胁迫因素的抵抗力，以及（iv）产生生物活性代谢物。 由于其对作物健康的重要性，对植物微生物组进行了长期的研究。

此外，在农业领域开发了广泛的微生物组管理策略和产品清单，包括（i）微生物组移植（粪便和生物动力添加剂），（ii）微生物接种剂，（iii）微生物和植物提取物以及（iv）改变环境条件的方法。 

在过去的几十年中，管理密集型农业主要依靠合成化学物质，导致严重的环境和健康问题以及生物多样性丧失。另一方面，对植物微生物组学的研究将支持针对田间特定条件的针对性和预测性管理方法，从而可以提高可持续性。 

种子/根际微生物组对植物至关重要，与我们的食物微生物群紧密相连

与人类肠道微生物组相似，种子/根际微生物组对植物至关重要，种子是下一代微生物的理想靶标。  Pérez-Jaramillo及其同事提出了种子的“回归根源”方法，这为揭示野生亲缘种和古代传家宝品种的种子微生物群提供了一个有趣的机会，以节省有益的种子微生物群用于农业。 

利用农作物野生近缘种的种子微生物群或利用有前途的生物资源，有可能实现植物与其特定种子微生物群之间的匹配共生。 收获后微生物群与我们的食物微生物群紧密相连，也可以针对食品的所需功能特性进行管理，例如安全性和保存性，感官或健康特性。 

这代表了一个相对尚未开发的基于微生物组的应用，它正在受益于食品生态系统中新出现的大量数据。

生活方式-微生物-人类-健康的联系

微生物群的重要性超出了个体宿主的健康。来自不同宿主和生态系统的微生物可以相互作用并相互影响。这些观察结果导致了“健康环境促进健康人类”的口号，支持“One Health”概念。

【注：“One Health”意指多学科共同合作,为人类健康,动物健康,环境健康三者共同成为一个健康整体而进行的工作和努力.“One Health”是一个新的名词,但是这一概念是很早之前已经存在的.2003年4月7日,华盛顿邮报的Rick Weiss引证了兽医博士William Karesh的话“人类和家禽或者野生动物的健康再也不能分开谈论了,世界上只有‘One Health’,所有的问题解决办法需要各个学科的工作人员共同努力,在不同的层面为问题的解决作出贡献.”关于“One Health”,目前国内翻译的名称非常不一致,比如“唯一健康”,“共同健康”,“一体化健康”, “大健康"等，编者在此不做翻译。

引自：Xiao Zheng, 陆家海, Sarah K.White,等. 应用"One Health"策略解决复杂健康问题[J]. 中华预防医学杂志, 2014, 000(012):1025-1029.】

根据世界卫生组织的说法，“One Health”是一种设计和实施方案、政策、立法的方法，以及多个部门进行交流和合作以取得更好的公共卫生成果的研究。“One Health”概念的扩展，包括环境健康及其与人类文化和习惯的关系表明，在社会决策和政策制定过程中，应考虑生活方式-微生物-人类-健康的联系（图7）。例如，城市化与过敏、哮喘和其他慢性病的增加有关。此外，在城市地区观察到总体污染模式，即微生物多样性的显著丧失，这与疾病的发展有关。

Dominguez Bello等人表明，伴随工业化而发生的人类微生物群的变化可能是代谢、免疫和认知疾病急剧增加的潜在因素，这些疾病包括肥胖、糖尿病、哮喘、过敏、炎症性肠病和自闭症。多样性的丧失反过来又与细菌对抗生素的耐药性增加相关，因此，需要实施策略来恢复建筑环境中的细菌多样性。了解不同宿主和栖息地的微生物群之间的复杂联系及其与人类、动物和植物健康的关系，为在One Health概念的背景下进行诊断、治疗和干预提供了创新和整体方法的潜力。

类似One Health，存在着将人类与环境健康联系起来的不同概念；行星健康概念是最流行的概念。许多国家和国际生物经济战略也承认这一主题，在这些战略中，可持续的生物产品生产满足了经济的需求。毫无疑问，要使这些概念成为成功的故事，不仅需要自然科学不同学科之间的相互关联战略，而且需要社会科学和利益相关者的整合。

然而，我们现在所面临的往往是相反的：生物多样性丧失、污染、臭氧消耗、气候变化、生物地球化学循环边界的跨越，都是人类世这个时代的特征。上新世也反映在行星边界概念中。

人类活动已经跨越了九个行星边界中的四个：气候变化、生物圈完整性的丧失、陆地系统的变化和生物地球化学循环的改变。

首先，研究表明，它们改变了整个微生物群落的功能和遗传多样性；然而，关于这些人为因素对不同微生物群落的影响及其对我们地球的影响的更多知识是绝对必要的。在这里，研究人员认识到迫切需要更多的研究，特别是关于环境微生物组和人为驱动变化的机制性见解。

了解海洋和陆生微生物群落及其相互作用可能是找到解决与上流新世相关的巨大挑战的关键。微生物群管理和基于微生物群的高潜力创新的开发在各个应用领域都是有希望的，但同时也应仔细评估这些新的和有前途的技术对环境的影响。

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结 语

基于该领域的最新进展，研究人员建议恢复Whipps等人提出的微生物组术语的原始定义。该定义包含了1988年发表后30年内仍然有效的所有要点，并通过两个解释性句子对微生物群和微生物组进行了区分，并宣布了其动态特征。

微生物组

微生物组被定义为一个具有独特理化性质的、占据合理、明确的栖息地的微生物群落。

微生物组不仅指所涉及的微生物，还包括其活动区，从而形成特定的生态位。

微生物组是一个动态的、互动的微生态系统，在时间和规模上都会发生变化，它整合在包括真核生物宿主在内的宏观生态系统中，对它们的功能和健康至关重要。

微生物群

微生物群由属于不同领域的微生物组成（原核生物[细菌、古生菌]、真核生物[例如原生动物、真菌和藻类]），而“它们的活动区”包括微生物结构、代谢物、可移动遗传元素（例如转座子、噬菌体和病毒）以及嵌入到栖息地的环境条件。

此外，作者认为以下几点对于微生物组研究至关重要：

1.核心微生物群是一组来自相似栖息地的微生物群落之间共享的成员，这对于了解稳定性，可塑性以及在复杂微生物组合中的功能非常重要。

2.从宏观生态学改编的理论可能有助于理解不同环境中微生物组动力学的模式，但需要验证其一般应用。

3.每个微生物组研究的基础都是适当的实验，方法和统计设计。 在设计中应通过以下方式实现空间，时间和发育的整合：（i）根据系统特性选择适当的采样频率，以捕获完整的核心和瞬时微生物区系；（ii）通过考虑系统的适当空间规模 认识到规模的子集也与微生物群评估有关，并且（iii）对于强动力系统，应考虑研究微生物分布的时空连续体，而不是捕获一个特定的矩/空间单位。

4.方法学的进步极大地推动了微生物组的研究。 尽管在这方面取得了所有进展，但是还没有完美的通用方法。技术工具箱将减少每种技术带来的偏差，并从整体上更完整地了解生物系统。

5.微生物功能在生态系统中起着重要作用。 因此，我们建议在微生物组研究中包括几种当前可用方法的组合，以便对微生物功能有更深入的了解。

6. 尽管在过去十年里，我们获得了大量的组学数据，但我们仍然缺乏关于其背后的生物信息。因此，在微生物组学研究中实施更多基于培养的方法需要大力的努力，这样可以描述特定微生物群的生态类型和适应环境的模式。

7.微生物相互作用是微生物群落功能和进化动力学的基础。 因此，我们提倡考虑研究设计中的相互作用。

8.宿主与微生物的相互作用决定了相互适应性，表型和新陈代谢，从而提出了微生物群及其宿主的协同进化理论。 我们建议基于进化的全基因组理论的整体方法。 整体人的疾病状态以生物失调（病原体组）为特征，而尤物病是指平衡的宿主－微生物相互作用（“健康”微生物组）。

9.根据微生物与宿主之间的相互作用，将微生物分为有益的，致病的和中性的是基于人类中心观。确实，宿主和整个微生物组的生理学在很大程度上影响相互作用的结果。

这些澄清和建议的应用将有助于研究人员以整体的方式设计其微生物组学研究，这将有助于开发微生物模型和预测，进而加快我们在生活各个领域设计应用程序的能力。

【参考文献】

Berg et al. Microbiome (2020) 8:103 

人类微生物组正逐渐成为个性化医学的一个关键目标

植物微生物组是下一次绿色革命的关键

我们一直在微生物领域助力科研，也希望为每个人的健康出一份力

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