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蛋白甲基化是一种普遍存在的翻译后修饰,并且在生物体中参与转录,信号转到与DNA损伤修复等重要过程。甲基化反应是由甲基转移酶(MTase)介导的,它将活化的甲基集团从S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移到氮氧硫为核心的氨基酸残基上。
通过对甲基化蛋白组进行全局分析能够提供一些关于甲基化蛋白和和甲基转移酶的有用信息,同其他翻译后修饰一样,利用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)直接从完整的蛋白质酶解产物中能够直接鉴定出数十种甲基化蛋白。另外,有一些特异性的富集方法应用在甲基化蛋白的富集上,例如通过抗体特异识别甲基化蛋白赖氨酸和精氨酸残基则可对其进行富集。通过利用代谢化学报告集团提供了一些新的机会发现感兴趣的翻译后修饰类型,在早期的研究中,SAM合成酶被设计用于体内SAM类似物的合成,可被蛋白MTase突变体原位标记染色质,并通过化学点击的方法富集得到标记蛋白。
现在,allyl-SAM类似物则被证明是多种野生型MTase的SAM替代物,allyl集团可以结合在不同的氨基酸残基上,并且许多生物的正交反应可以很容易的得到allyl集团,据此设计了如下实验策略:
为了促进体内蛋白质发生烯丙基化(allylation),有一些问题需要考虑。
首先,应该开发一种有效的方法将allyl-SAM转移到细胞中,其次,内源性的SAM的竞争应被抑制。为此,通过使用了作者之前构建的SAMauxotrophic菌株,如图1A所示,细胞在SAM的环境下进行培养,然后转移到allyl-SAM的培养基中,因此,内源性的SAM被迅速消耗,根据辅因子分配机制,因为那些工程改造的细胞是无法合成SAM的,最终细胞必须使用替代的allyl-SAM来支持细胞的各种生物过程。总的来说,这些数据表明细胞吸收了allyl-SAM,并可能通过内源性的MTase介导了体内烯丙基化。
图1
为了捕获烯丙基蛋白,通过钯元素催化的Heck反应连接上功能芳基。图2A中是天然的MTase介导的蛋白烯丙基化反应,然后通过氧化Heck反应引入报告集团,图2B中是蛋白Npl3和Hmt1蛋白混合物的考斯亮蓝染色和荧光分析,样本在含有allyl-SAM通过海克反应能够检测到其荧光信号,而未能在不含有allyl-SAM中检测到。图2C中是检测含有allyl-SAM和不含有allyl-SAM的培养基中检测细胞提取物的情况,箭头所示差异条带,对蛋白提取物用生物素进行标记(biotinylation)。
图2
随后通过抗生物素亲和纯化富集allylated蛋白,随后通过采用Labelfree的方法分析。
其中被检测的167个蛋白展示了酵母蛋白甲基化的整体概况,这发生甲基化蛋白只占全部蛋白的2.4%,然而更多的蛋白是甲基化底物,因为野生型Mtase介导的烯丙基化的效率低于甲基化。
总的来讲,此文设计了一种集合体内蛋白烯丙基化和化学捕获的,可对酵母蛋白甲基化全局进行研究。数据表明Gnd1和Hxk2蛋白的甲基化位点在细胞代谢过程中起至关重要的作用,根据此方法,可进一步了解所有蛋白甲基化的发生情况,以及激发对赖氨酸精氨酸甲基化以外的蛋白甲基化功能更进一步的研究。
此文主要虽然是利用特定的细胞模型研究蛋白的甲基化情况,但是对我们研究其他蛋白翻译后修饰提供了好的思路和方法,质谱手段结合化学手段研究蛋白修饰已经愈来愈普遍,使发现新位点成为了一种可能。
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