因为这段时间实验的需要，总算有机会好好研究一下引物设计的方法，虽然有在网上找了一些课程，但是受到英语和其他相关水平的局限，总有些地方不是能看的太懂，所以就选择一种自己能够熟练掌握的方式，基本能满足自己的要求。写下来，算总结，也算分享，万一有人觉得还可以，我也挺高兴。关于引物设计的软件，有Oligo，DNAMAN等等，但是我目前只应用到Oligo。

使用情况一：将目的片段导入新的载体中。

对于Oligo的操作，首先通过File--New Sequence在打开的框中输入DNA模板序列，或者点击open直接添加文件，再点击√就可以了。（或者可以直接利用快捷键Ctrl+C/V进行复制粘贴）。

引物一般由保护碱基、酶切位点和与模板的互补序列三部分组成，长度一般在18~30bp。

1.1 酶切位点的选择，我们要确保目的片段与载体上有且仅有一个该酶切位点。我常用的方法是利用NEBcutter  V2.0，将目的片段的碱基序列输入框中（我常用的是Linear），选NEB enzymes，然后提交，会出现该目的片段上所有存在的酶切位点分析，选 0 cutters，即序列上不存在的酶切位点，再将搜索结果与待连接载体的MCS区域相比对，找到两个合适的酶切位点就可以了，（注意，所选的酶切位点不能靠的太近，最好不选相邻的酶切位点，他们之间的距离最好至少在几十个碱基以上，可以选择实验室常用的一些酶）。

1.2 保护碱基的选择，可以附件NEB保护碱基表， 在表格中找到相应的酶进行选择，优先选择裂解率高的保护碱基。

NEB保护碱基表.doc

       1.3 与模板互补的片段，引物中需要有一小段片段与模板相结合，才能保证PCR过程的进行。可以先选择15bp左右，后期可进行调节修改。

由于有点时候没办法单纯靠想象记住这些序列，所以我常会在纸上将这一部分写出来分析，更加的直观。方法虽然比较笨，但是很有用，尤其是反向引物的设计，因为复制方向是5’-3’，需要的是反向互补序列，这个时候更容易出错。

选择Edit-Forward Primer，将初步设计的引物输入，点√确定。引物会自动对应到模板的位置上。注意复制进行的方向，不要设计反了。

下游引物的设计原则和上游引物一样，但是所需的是互补序列，选择Edit--Reverse Primer进行输入就好了。

初步引物设计好之后需要进行分析来验证引物的有效性。这一部分主要在Analyze里面进行验证，主要包括引物二聚体的形成，发夹结构的形成，G/C含量，错配情况及同源性等方面。

2.1 引物的3’端最好保证是游离状态，有助于产物的伸长延伸，而5’端没有这个要求。

2.2 引物自身或引物之间不能带有连续4个以上碱基的互补，引物二聚体及发夹结构可能会导致PCR反应不能正常的进行；

2.3 引物的G+C含量在40%~60%之间，过高或过低都不利于引发反应；

2.4 错配情况及同源性中，正确的产物对应的数据应该是最高的（above the threshold），这样才能保证正确产物的优胜表达。

2.5 上下游引物的Tm值差值不应超过5℃，退火温度按较低的Tm值选定。

在分别验证完之后可以选择Analyze-PCR进行模拟PCR，可以根据提出的建议进行修改。

    使用情况二：敲除一小段基因片段。

    Oligo的使用情况与上面所述相同，但是引物的组成上没有另外附加的酶切位点和保护碱基，此时引物分为两部分，前半部分与待切去片段前面的那一段序列互补，后半部分与待切去片段后面一部分互补。（参考：下图中被切去片段为118~180bp部分）

切去基因片段时应注意：

  新的产物仍然可以表达，确保启动子没有被切除，则需要在该序列前面找到启动子的位置，在质粒图谱中可以看rbs和密码子ATP的位置。

  切去的碱基数量应该是3的倍数，这样才不会有移码的情况。

暂时先想到这些，注意事项可能缺少很多东西，以后见到更多情况的时候再回来查漏补缺。

如果有问题可以告诉我，一起查漏补缺，一起学习交流 。