今天跟大家分享的这篇文章来自于The Crop Journal“小麦功能基因组”专辑（Volume6， Issue1），该专辑详细地论述了小麦功能基因组，基因组测序、转化和基因组编辑、抗逆、籽粒品质、发育转录组学、小麦病原菌基因组学以及我国西南地区—中国春故乡的小麦育种历史和经验等，具体可以参见我们之前的推送“The Crop Journal小麦功能基因组专辑”。文章的题目为“Mapping stripe rust resistance genes by BSR-Seq: Yr_MM58 and Yr_HY1 on chromosome 2AS in Chinese wheat lines Mengmai 58 and Huaiyang 1 are Yr17”，通讯作者是遗传发育所的刘志勇研究员，第一作者为中国农业大学的Yong Wang。

     研究小麦条锈病的重要性就不多说了。两个育种品系Mengmai 58和Huaiyang 1均表现出较强的成株期抗性，作者利用这两份材料分别和感病亲本Nongda399进行杂交并创制分离群体。遗传分析表明，两份抗病材料中均含有单显性抗病基因Yr_MM58和Yr_HY1。作者利用BSR-Seq技术分析发现，Yr_MM58和Yr_HY1均被定位在2AS染色体末端大约16Mb的一个物理区间内，与已经报道的小麦条锈病抗病基因Yr17定位区间一致。

     为了进行BSA分析，作者在群体Nongda 399/Mengmai 58中分别选了20份纯合抗病和20份纯合感病F_2:3家系的苗期叶片材料进行抗池和感池的RNA混样，群体Nongda 399/ Huaiyang 1则分别选了40份纯合抗病和40份纯合感病F_2:3家系叶片材料。对于取材小编想啰嗦几句，我们还是建议大家尽量取发病之前的叶片，这样能够保证抗感池里表达的RNA尽量平衡，以便于后续的SNP分析。同时，条件允许的前提下还是尽量多地增加样本数量，比如每个池可以取到50—60个单株或家系。后续的测序和分析流程应该比较成熟或流程化了：文章中用的HiSeq4000平台进行测序，现在可以选择Nova平台，既快又便宜；RNA-Seq的数据可以用Hisat2或STAR等软件比对到小麦参考基因组中，参考基因组可以选择IWGSC或TGAC的版本；SNP和InDel可以用GATK或Samtools等工具进行鉴定，具体流程和脚本也可以参考我们之前的推送“call variants from wheat RNA_seq”。

     经过BSR-Seq分析之后，作者在两个抗感池中分别鉴定了128,502、131,825个SNP或InDel。通过计算等位基因频率（allele frequency difference， AFD）和Fisher检验进行过滤，分别鉴定出了19个和24个SNP与Mengmai 58和Huaiyang 1中的抗病基因连锁。其连锁区间均位于2AS染色体端部的相同区间，说明这两个材料中的抗病基因可能相同。为了进一步缩小候选区间，作者又比较了粗山羊草、短柄草、水稻和高粱的共线性区域，只有粗山羊草2DS相对应区间与中国春2AS共线性关系相对较好，因此被用作新标记开发。最终作者将Mengmai 58和Huaiyang 1中的抗病基因定位在距STS标记WGGB148约7.7cM和3.8cM的区间（如下图）。

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     小编猜测作者在做这个工作的时候应该比较早，小麦参考基因组的物理图谱远没有现在完善，所以作者通过分析粗山羊草的共线性区段开发新的分子标记。现在大家做类似的工作时完全可以参考IWGSC RefSeq v1.0（https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies），直接根据目标区间的物理图谱进行标记开发。如果你的目标区间与中国春共线性关系不好，也可以综合中国春A、B、D基因组以及野生二粒的A、B基因组的共线性关系进行标记开发（GenomeRedesrch上的doi:10.1101/gr.217117.116文章有中国春ABD基因组共线性基因的信息，SCIENCE上的DOI: 10.1126/science.aan0032文章有野生二粒AB基因组共线性基因的信息）。至于标记开发，大家可以利用重测序技术直接寻找InDel并开发成InDel标记，重测序的深度在10-20X即可。