在郊外简陋的临时靶场，面对那群因目睹“自制”开花弹强大威力而群情激奋的湘军头领，曾大帅“秀”出他得意弟子（李鸿章）刚刚呈献的“千里眼”……

——曾国潘（小说）

20171218

更上危楼,咱能看多远?

一、   专利名称：《一种血清学检测与定量分析的方法》

专利号：   ZL2015 1 0473549.7。

发明人主体：华中科技大学附属同济医院医学实验中心

退休职工。李方和

发明目标：针对当前阻碍血清学检测技术发展瓶颈（定量范围狭窄与Hook效应干扰），制定了相应的纠正方案。

（Hook效应及定量范围狭窄）

发明内容：

“专利要求”内容见前博文：

http://blog.sciencenet.cn/blog-588287-1088675.html

主要发明点：                        

1、   先在试验中发现LiCA检测实验信号强度改变的依时性规律，提出单纯二次激发概念，并将其用于LiCA的定量分析；

2、   首先发现部分均相（含单纯均相与类均相）免疫反应中HB双向剂量反应曲线的规律（全程类抛物线图像）与某些潜在特征（如顶点摆动等），首次提出以HB双向曲线取代传统线性曲线进行定量分析参比；

3、   以上述两项特征为基础建立一种新的数据分析手段，破解HB双向曲线图像中“实验数据镜像现象”难题；

4、   提出以HB双向曲线取代原有标准曲线，以曲线回归取代原传统的直线回归，从而极大拓展血清学检测定量分析范围；

5、   将多重曲线回归用于HB双向曲线的拟合与参比分析，从而极大提升曲线回归的实验精度（剂量分析精度等于甚至超过传统的分析方法）。

应用范围

1、   应用领域：生物学领域内抗原与抗体的血清学定量检测；

2、   具体方法：血清学检测中均相与类均相免疫检测方法（主要为LiCA）；

3、   检测对象

所有的抗原及抗体；全程的自然表达浓度范围。

浓度状态                 检测目标

超高浓度免疫物      一次检测确定标本的自然表达浓度

  中高浓度免疫物质    消弭Hook效应，一次性定量浓

  低浓度免疫物质      排除Hook效应，拓展敏感性提升空间（媲美PCR）

4、   技术示范效应

首次提出通过数据处理方式大幅度拓展定量分析范围的技术路径，为其它免疫学检测技术，其它生物学（如生物化学）检定量分析技术，以及其它物理与化学分析技术的发展提供借鉴。

（相关工作已在进行中）

技术效果

1、   能消弭LiCA实验定量检测中Hook效应（结合技术秘密）；

2、   能通过一次检测达成对所有浓度自然表达抗原的定量分析（拓展100-1000倍，适当调整所依托方法后能达成全程定量的目标）；

3、   能保留所依托方法的全部技术特征；

4、   能为该技术的进一步发展提供进一步的拓展空间；

专利应用举例

【实施例1】时间依赖性多时点分析方法在光激发化学发光（LiCA）（以下简称多时点LICA）检测血清中HBsAg的应用（先BA结合型LICA实验）

（一）实验材料

1．仪器与耗材

1）实验仪器：LiCA HT光激化学发光检测仪，中国博阳生物（上海）科技有限公司制造。

2）人工智能数据处理系统：自制软件处理系统。

3）实验耗材：同上由中国博阳生物（上海）科技有限公司提供。

2．实验试剂和标本

1）LiCA HBsAg检测试剂由中国博阳生物（上海）科技有限公司生产，市售获得。包括：

试剂1：R1.Anti-HBs包被发光微球;

试剂2：R2.生物素化的anti-HBs;

试剂3：R3.包被链亲和素（SA）的感光微球;

试剂4：实验稀释系统，市售试剂系统携带；

2）参比标准品

①自制参比品储存液：自感染者血清中纯化（密度梯度离心法，BSA参比光谱吸收法定量），浓度7.62mg/ml，置-30℃冻存。

②自制参比品：该提取物采用实验稀释系统调整浓度（2400.0μg/ml）,经浓度标定后稀释，适量分装，-30℃冻存，供室内标准参比，及回收实验标本使用。参比品浓度与数量的设定规则与HB双向曲线结构及其拟合方式关联并参照临床检测的方便程度（表1），具体使用浓度见表2。回收实验标本的设定参照表3。

③市售参比品：市售LiCA试剂盒随带，共6份。HBsAg浓度分别为：0.0 ng/ml，0.6g/ml，4.6 ng/ml，18.3 ng/ml，200.0 ng/ml，500.0ng/ml（定量上限500ng/ml）。

3）对照血清

阴性对照与阳性对照血清：市售试剂盒携带，用于域值确认，及试剂反应性评价。

4）检测标本：血清、血浆、体液、或体外培养物。

3.人工智能分析系统

“复合HB双向剂量反应曲线图像法分析体系”，其宏观逻辑框架见发明内容。用于血清HBsAg检测的专项智能分析系统构建亦在上述分析系统的框架内完成（见后分析系统构建）。

（二）实验步骤

1．实验准备：

取出所有试剂与标本，恢复至室温，按需调整至工作浓度。

2．实验操作

1）取试剂R2、R3等体积，混合，室温放置15min；

2）加至LiCA实验反应板各孔中，每孔（管）200μl；

3）加入R1（100μl/孔（管）），混合；

4）取待测标本，阴、阳性对照，及HBsAg定量标准血清系列各25μl，分别加至LiCA反应板各孔中，每份标本加一孔；

5）混合实验体系,置LiCA发光检测仪上，育温15 min（此时间点即为T1）。（注意消除各孔间免疫反应时间差，下同）；

6）在680 nm激发，610nm波长检测条件下检测各孔实验信号（S1），并将各信号值输送至人工智能数据处理系统；

7）继续放置15min（达T2时点，即标本与实验体系混合后30min）；

8）置LiCA发光检测仪上，680 nm激发，610nm波长检测各孔实验信号（S2），并将信号输送至人工智能数据处理系统；

9）由人工智能系统根据实验者指令对上述实验信号进行综合分析，并报道检测结果。

（三）实验分析系统构建与应用

1、专项靶物质（即HBsAg）检测分析系统的构建过程

1）采用超过100个浓度点的系列HBsAg稀释标准参比品，浓度范围设定涵盖整个HB双向曲线有效图像，样本的浓度区间设定为质点间间隔0.025—0.10个横轴读数(X轴），进行10次或以上重复LICA检测，取每个浓度点各次LICA检测的实验信号平均值作为该点对应的实验信号；

2）于整个反应体系混合后的不同时点（免疫反应经历的时点，T1及T2）检测实验信号（S1及S2）；

3）将实验数据纳入人工智能分析系统，启动系统中曲线模拟程序，进行普通及高密度质点函数实验参比曲线图像模拟（一次或多次，整体模拟、分隔模拟与分段模拟相结合）。并据此形成用于血清HBsAg检测的实验结果分析体系；

4）采用高溯源质控物以同上方式对上述曲线进行模拟核对（可用低密度拟合）；

5）有选择性地将该程序用于不同地区检测单位，通过具体的田间实验验证并修正分析系统。

2、复合HB双向剂量反应曲线图像法人工智能分析系统软件数据处理路径：

1）获取并计算实验结果，得到S1、S2、SSDI三组数据；

2）应用实验参比品检测数据输入，调出并修正机内储存实验体系，构建出适合当次实验使用的复合HB双向剂量分析曲线图像分析系统；

3）通过对HB双向剂量反应曲线及其曲线回归分析方法的应用，为Hook效应的消弭及其定量范围的显著拓展提供有效的定量分析空间；

4）综合应用S1双向曲线、S2双向曲线，及SSI曲线，三者间关系的分析结果，确认检测标本靶物质浓度（真值）查读所采用的曲线区段，以此解决双向曲线参比分析中的对映值现象对实验结果分析的干扰。

5）应用顶点偏移（或称顶点漂移）的实验现象解决围顶点效应造成的局部区段（围顶点区段）定量分析精度下降的问题。（具体方法如示意图2所述）；

6）利用类Hook效应判点，标识出曲线右侧低信号区段内定量分析精度下降的标本（该现象仅出现在极其罕见的超高靶物质浓度的实验标本中）；

3、人工智能系统软件路径的图像法显示

该系统运作的基本路径可以由复合HB双向剂量反应曲线图像加以显示。其具体绘制方法可简括为：①输入并处理全部数据,绘制出三条曲线（S1、S2、SSI）；②通过计算确认S1及S2曲线的顶点；③在人工智能软件引导下绘制M辅助线；④根据辅助线M与三条曲线的交点定位A1、A2及Q三点，并确认其函数点值（y与x）；⑤以此三点点值为参照确定结果查读区段，并查读被检测标本的靶物质浓度。上述界点均系通过解析函数法计算求得。

4、实验结果分析技术路径

1）输入实验标本序号，人工智能系统自动查读被检测标本当次实验中的信号检测强度S1、S2，计算其SSDI，并将其与当次分析系统选定的Q界点值进行比较，以确定实验结果在图像分析系统上的查读区段；

2）结果查读（计算）区段采信标准：

SSDI值大于Q值：根据T2时点信号强度在S2双向曲线A2界点的左侧查读检测结果；

SSDI值小于Q值：根据T1时点信号强度在S1双向曲线A1界点的右侧查读检测结果；

3）阴阳性结果的判断

以阈值（即空白孔实验信号×2.1）为界点判断，低于此值者为阴性；高于此值者为阳性，阳性者须做靶物质浓度的定量分析。

4）阳性结果的定量分析

依据各自测定数据（实验信号，即y），采用公式法计算（由分析系统执行）被测定标本在S1及S2两条双向曲线上指定查读区内的靶物质浓度对数（即实验信号Y的对应函数x，计算公式：，计算方法参照分析系统建立，并反向进行。

5）将所获取并采信的x函数（浓度的对数数值）转换为靶物质浓度值（ng/ml），并根据实验者指令输出实验结果。

（四）实验结果

1、血清HBsAg检测时间依赖性多时点光激发化学发光实验（以下简称多时点LiCA）的实验结果定量分析系统见图2。

2、几项主要的分析数据

实施HBsAg多时点LiCA检测所需要的有关中间数据由分析系统运算后取得，本次实验部分关键的界点数据见表1。

表1 HBsAg检测先BA结合型多时点LiCA实验结果分析中间数据

*：表中阈值的计算方法系根据既往文献习惯沿用，亦可根据其它方式确认；#：辅助线M即为界点承载线，此线上各个界点值的x值相同（Pe（x）=(P1（x）-P2（x）)/2=Q=A1=A2），y值取自M与各曲线的交点。

3、采用多时点LiCA检测标准参比品浓度及其定量分析实验结果见表2

表2血清HBsAg专利法LiCA检测标准参比品浓度设定及实验结果

4、回收实验结果

采用多时点LICA对一组系列稀释的自制参比血清进行检测，并以前述建立（试验阶段）的人工智能系统对检测结果进行分析。实验结果见表3。

表3血清HBsAg先BA结合型多时点LiCA检测回收实验结果

*：饱和度指数：计算方法为SSDI=（S1/S2）×100×10000，不同实验方法所采用的系数不同；

5、临床检测结果

1）采用多时点LiCA对一组临床标本进行检测，并与常规LiCA进行比较，结果见表4。72例未经筛选的临床患者，两法HBsAg阳性检出率均为16.7%。常规LiCA检测因Hooks效应导致的定量检测结果总体偏离率达50.0%。其中定量失报率（即因溢值状态而不能给出确切定量数据标本）为16.67%；定量错报率（结果偏离真值5倍以上）33.3%；

表4先BA结合型多时点LiCA临床检测及其与常规LICA的比较

*：血清采集当日检测单位的实验编号。#：常规LiCA检测未能报道确切浓度的标本。

2）采用多时点LiCA对一组雅培化学发光定量检测溢值（二步免疫法，>250 IU/ml，67份）的血清标本进行检测，并与常规LiCA进行比较。全部血清两法HBsAg检测均阳性，其浓度均值分别为6729.32±1396.26及217.85±69.73，前者均值为后者31.03倍。未发现浓度依赖性假阴性现象。其检测结果的浓度区间分布见表5。

表5采用两种LiCA对一组雅培试剂HBsAg溢值血清检测结果

*：例数/百分率（以全体实验对象为100%）

（五）多时点LiCA检测的实验信号衍变特征

  采用同上实验方法进行检测，于免疫反应的不同时点（T1、T2、T3、T4、T5）进行实验信号（S1—S5）采集，并以同上方式将其绘制到复合HB双向剂量反应曲线图像（图3）中，结果显示，在既定的时段内，因反应时点改变而导致的实验信号强度变化并非局限于前述专利法中的某特定时点，而顶点摆动现象亦出现在所观察时段免疫反应的全过程。

（六）结论：

1、方法敏感性：两法（多时点LiCA与常规LiCA）相同，＜1.0 ng/ml；

2、定量范围：

常规LiCA：1.0---500（1000）ng/ml；

多时点LiCA：1.0---100 000～1 000 000 ng/ml。

两者比较：专利法LiCA较常规LiCA拓展100～1000倍。

3、实施效果：

1）通过对HB双向剂量反应曲线及其曲线回归分析方法的应用，显著拓展常规LiCA的定量分析空间；

2）综合应用S1双向曲线、S2双向曲线及其SSI曲线三者关系的分析结果，确认检测标本靶物质浓度（真值）计算与查读所采用的曲线区段，以此解决双向曲线参比分析中的假性对映值对定量分析的干扰；

3）应用顶点偏移（或称顶点漂移）的实验现象，解决围顶点效应造成的局部区段参比定量分析精度下降的问题；

4）利用类Hook效应判点，标识出曲线右侧低信号区段内实验精度下降的标本（该现象仅出现在极其罕见的超高靶物质浓度的实验标本中）。

5）对不同时点采集的两条HB双向剂量反应曲线实施分别拟合，分段拟合及其分别应用，为提升定量分析结果的精度提供了重要的保障。

附录：

专利文书的“专利说明”部分

（略）