• 测序原理
  

Nanopore是一种单分子,实时测序的新一代测序方法，其以单分子DNA（RNA）通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。具体测序原理如下图所示：

图1： Nanopore 测序原理

1.        解螺旋，将双链DNA解开成单链。

2.        DNA单链分子通过一个孔道蛋白，孔道中有个充当转换器的蛋白分子。

3.        DNA单分子停留在孔道中，有一些离子通过带来电流变化，而不同的碱基带来的电流变化是不同的。

4.        转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化。

5.        根据电流变化的频谱，应用模式识别算法得到碱基序列。

测序读长

因为测序原理无需要DNA聚合酶的链式反应，所以不存在DNA聚合酶的失活问题，理论上只要DNA分子不断开，就一直可以通过纳米孔，目前在对于人和大肠杆菌的测序种观测到的read是1Mb。

要问测多长，请问您提取的DNA是否够长？下边让我给出人基因组的Nanopore测序的数据吧²。

表格1：三种不同建库方法Nanopore测序情况²

数据说话，Ligation建库方法测序读长的readN50达到14k左右，超长建库方法read N50达到 100k。

测序准确率

Nanopore测序准确率和Pacbio持平，为86%左右^1-3。

测序read的平均准确率为90%（如图二所示），如果选择测序方式，即对于DNA的正负链都进行测序，可以达到96%的准确率。详细的情况见图2。

图2  A：Nanopore 对于DNA进行1D和1D2 测序的read平均质量值B: Nanopore测序错误率分布。

高质量基因组

目前，Nanopore的长read主要应用于高质量基因组的组装，尤其是对于高杂合，高重复，大基因组等复杂基因组。2016年前，主要用于一些小基因组如大肠杆菌，酵母，线虫等，目前已经应用在在人，野生番茄，香蕉，欧洲鳗等多个复杂基因组组装上。

图3：Nanopore 基因组分析流程图。

参考文献

1              Magi, A., Semeraro, R., Mingrino, A., Giusti, B. &D'Aurizio, R. Nanopore sequencing data analysis: state of the art, applicationsand challenges. Briefings inbioinformatics, doi:10.1093/bib/bbx062 (2017).

2              Jain, M. et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome withultra-long reads. bioRxiv,doi:10.1101/128835 (2017).

3              Schmidt, M. H. et al. De novo Assembly of a New Solanum pennellii Accession UsingNanopore Sequencing. The Plant cell,doi:10.1105/tpc.17.00521 (2017).