1. 实验目的
建立秦皮乙素的标准曲线并测定秦皮乙素样品的浓度。
2. 实验原理
色谱法的分析原理是溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中的滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。HPLC以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。其分离机制与常规柱色谱相同，但填料更加精细，需高压泵推动，柱效高，分析速度快。在实际操作中主要通过改变流动相的组成来调节样品在色谱柱的保留值和选择性，从而使不同样品得到分离。
由于每一种化合物在特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱、柱温等相同），其保留值具有特征性，因此可以利用标准样品和未知化合物的保留时间进行定性分析。
在色谱中，被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比，可以采用标准曲线法，将对照品溶液稀释至不同浓度的标准溶液，绘制出标准曲线。把样品溶液的响应值代入标准曲线从而进行定量分析。
3. 实验方法：
3.1 仪器与材料
3.1.1 试剂与耗材
名称 | 供应商 | 货号 | 批号 | 有效期 |
秦皮乙素 | 上海源叶生物科技有限公司 | B20989-20mg | C25J7Y18390 | -- |
甲醇 | Merck | UN1230-4L | 1060074008 | 2021/08/31 |
3.1.2 仪器
名称 | 型号 | 供应商 |
液相仪 | UPLC 1100 | Agilent |
超纯水 | ELGA PURELAB Option-S7/15 | ELGA |
色谱柱 | MultoKrom 100-5 C18, 4.6×250mm | Agilent |
3.1.3 色谱参数
液相色谱仪 | Agilent UPLC 1100 | ||
色谱柱 | MultoKrom 100-5 C18, 4.6×250mm | ||
流动相 | 纯水，甲醇 | ||
上样量 | 5 μl | ||
柱温 | 35 ℃ | ||
流速 | 0.8 ml/min | ||
梯度 | 时间（min） | %A（纯水） | %B（甲醇） |
0.00 | 85.0 | 15.0 | |
5.00 | 70.0 | 30.0 | |
15.00 | 55.0 | 45.0 | |
25.00 | 45.0 | 55.0 | |
26.00 | 10,0 | 90.0 | |
41.00 | 10,0 | 90.0 | |
42.00 | 85.0 | 15.0 | |
57.00 | 85.0 | 15.0 | |
紫外波长 | 310 nm | ||
3.2 样品处理
3.2.1 样品信息
样品结构：
图1.秦皮乙素结构式
3.2.2 样品制备
标准品用超纯水稀释至终浓度分别为 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/mL。
样品用超纯水稀释至终浓度为2 mg/mL。每个浓度的标准品和样品都准备三个平行样。
4. 实验结果和分析
4.1定性分析
如图2所示，将秦皮乙素标准品（A）和样品（B）的紫外吸收光谱图进行比较，出峰位置一致，即保留时间均在15min左右，则可判定所测样品为秦皮乙素。
图2.秦皮乙素标准品(A)和样品(B)色谱图
4.2定量分析
取秦皮乙素对照品溶液适量，加甲醇配制成不同浓度的标准品溶液，在3.1.3条件下进行色谱分析，以进样浓度（mg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，结果见图2，可知范围内线性关系良好。
图3. 秦皮乙素标准曲线
秦皮乙素样品峰面积的平均测定值为22120.03，根据线性回归方程求得样品中秦皮乙素浓度为2.36 mg/mL。实际浓度偏高的原因可能是在样品溶液浓度由10 mg/mL稀释到2 mg/mL过程中操作不当，或者样品溶液未混匀完全，导致部分溶液浓度偏高。
5.结论
1. 定性分析：样品中物质的保留时间与秦皮乙素标准品中的保留时间一致，表明样品中的物质为秦皮乙素。
2. 线性回归：由秦皮乙素标准曲线可看出，秦皮乙素标准溶液浓度在测定范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性范围适当。
3. 定量分析：由秦皮乙素的标准曲线方程求得样品中秦皮乙素的浓度为2.36 mg/mL，实际浓度偏大。
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