新月弯孢霉菌丝 转化RS制氢可新工艺联产14ɑ-羟基-RS的应用潜力
杨顺楷 四川 成都
1. 副产物也是很有用的甾体药物新中间体
虽然Peterson DH等早在1958年就报道了微生物对皮质甾体化合物的14ɑ-羟基化，但是对于利用该中间体研制具有生理活性的甾体药物，国外却是过去近20年余年来才见诸文献报道,而国内仅在近年才开始有所重视14ɑ-羟基-甾体化合物的新药开发研究。
据文献报道，14ɑ-羟基甾体化合物已经在分子药理水平上探明对心血管系统起作用，如14ɑ-羟基-5 b，14b–孕甾烷的C3糖苷衍生物与心肌中的强心苷受体发生较强的作用。此外，14ɑ-羟基甾体化合物在癌肿甾体新药研制上有重要价值，例如6 b，14ɑ-二羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮和14ɑ-羟基雄甾-4-烯-3，6，17-三酮2种雄性激素类似物，均可开发成为乳腺癌细胞抑制剂新药，后者还有抑制人体胎盘和子宫肿瘤中之芳构化酶活性及雌激素的生成。国内近年葛文中等专门开展了从土壤分离筛选的总状毛霉（Mucor racemosus）ACCC 0401菌株对具有4-烯-3酮类的C-19和C-21甾体的生物转化研究，生成的主要产物是14ɑ-羟基-甾体化合物（微生物学报，2007,47（3）：540-543）。可见，生物转化“副产物”也是很有用的甾体药物新中间体，故联产开发RS制氢化可的松新工艺及其伴生的14ɑ-羟基-RS副产物确有相当的重要性。
2．新月弯孢霉替代蓝色犁头霉的可行性
近年，我们实验室在开展针对我国传统基本糖皮质激素之一——氢化可的松生产线的瓶颈工段霉菌氧化进行技术改造研发，拟采用新月弯孢霉（Curvularia lunata）AS 3.4381替代1963年选出投产至今还在使用的蓝色犁头霉菌种（Absidia coerulea）AS 3.65。实验室研发已经达到的技术水平是：采用新菌种新月弯孢霉生长培养好的活性菌丝，在磷酸缓冲液介质体系中顺次连续两批次生物转化RS制氢化可的松重量收率已达到国际先进水平（55-60%）；此外，尚有可达20%的该小型丝孢真菌新月弯孢霉固有副产物14ɑ-羟基-RS副产物，因此探讨该副产物的应用潜力如前所述就很有必要。
现在已经广泛了解作为丝孢真菌的新月弯孢霉（Curvularia lunata）或者它的有性型世代（Cochliobolus lunatus）能够向孕烷甾体化合物C11b-位引入羟基，已知成为最有效的生物催化剂菌种之一，且活性菌丝生物转化底物RS和RSA C11b-羟化酶比活性分别为21um/g.h和7.1um/g.h，显然选择RS作为转化底物进行C11b-羟化反应速度比之RSA快得多；近年，俄罗斯学者开展了对新月弯孢霉菌丝体羟基化甾体活性的研究，指出其对数生长期的菌丝体在磷酸缓冲液的微结晶悬浮介质体系中呈现对RS有最大的11-羟化活性；而在真菌生长的较晚时期收获的菌丝体转化甾体就呈现14-羟基化酶活性，这就必然产生14-OH-AD；伴随着RS的主流转化，还研究了各种工艺操作条件对转化的影响，内容包括底物添加到反应混合物中的不同方式，菌丝浓度及菌龄，真菌纯系物作为生物催化剂对重金属盐赖受程度（0.35-0.5%），以除去14-OH副反应的影响。结果表明真菌纯系物可耐受Co2+和Cu2+的菌丝显示较弱的羟化酶，或是其彻底缺失酶活性，同时却观察到了天然菌丝体黑色素量的升高，这表明在其不利的环境条件下强化了黑色素的生物合成。这就表明利用新月弯孢霉菌丝体研究甾体转化本质上是对外生化合物存在时的一种药物代谢的脱毒过程。加之，结合我们实验室建立的行之有效的两级发酵生长培养及顺次连续两批次生物转化操作工艺都表明有高的生物催化活性，高的操作稳定性及较高的区域和立体选择性。这就为新月弯孢霉替代蓝色犁头霉的生物制造新工艺提供了可靠的科技研发基础。
结合当前我国工业生产已达100t/a氢化可的松产出量而言，対伴生的副产物低效利用的表皮醇（11a-羟基-RS，再用化学法生产可的松或强的松）及其长期忽视菌丝吸附甾体的损失量（至少10%）而言，这对耗用薯蓣皂素500t/a也是对半合成工艺宝贵薯蓣资源的非经济性低效利用，不符合新世纪化学化工绿色制造（提高资源利用率，降低能耗，对环境友好）的理念。
3．霉菌氧化长期徘徊原因探讨
所谓的霉菌氧化，从生物化学本质而言，就是在基本抗炎皮质甾体药物氢化可的松工业生产中，依赖半合成原料薯蓣皂素经多步化学合成到RSA，化学合成工艺接近国外先进水平，再经最后一步关键的也是最昂贵的生物制造步骤，即微生物合成工艺——C11b-羟基的引入（化学法不能实现），长期使用丝状真菌蓝色犁头霉AS3.65，成为了最不理想的低效的生物转化工段，氢化可的松重量收得率在43-45%之间长期徘徊。因此如何进一步地促进生物法引入C11b-羟基化有更好的区域和立体选择性，减少或降低副产物的生成一直是业内追求的首要目标。主要针对生成的11ɑ-羟基-RS（表皮醇）副产物可以低效利用，造成多年来固守“一步法”的粗放发酵工艺;加之蓝色犁头霉AS3.65固有的较低立体选择性，虽然该菌对RSA有较高的C21-OAc水解活性，能完成RSA到氢化可的松有43-45%重量收率，但是与国际水平从薯蓣皂素计算为27%，而我国为19%的总收得率比较而言，霉菌氧化的《甾体微生物工程》数十年来已形成了难以提升的“天花板效应”。长期以来“重化学合成，轻微生物技术及工程研发”的思维定势，故从菌种到工艺的应用一直弱势，这就造成了化学化工与生物学科交叉的研发过程一直处于难于有效运转的态势。
4．科学合理的设想
可以合理推断，如采用新月弯孢霉新工艺替代蓝色犁头霉的传统霉菌氧化，以现有的业内共计需耗用薯蓣皂素500t/a半合成原料，仅产出100t/a氢化可的松计算，可多产出5-7t/a氢化可的松产品；同时可回收的 14ɑ-羟基-RS作为新型甾体中间体可用于开发前述的心血管及乳腺癌细胞抑制剂新药之用，完全符合当前流行的“生物炼制”发展趋势和国家“十二五”工业生物技术生物制造的理念，可促进我国传统皮质甾体行业的技术进步和技术改造。在这一进程中逐步使我国从甾体药业大国成为名符其实的甾体药业强国。
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