再次论述：放线菌目2菌株胆固醇分解代谢途径研究新进展及其工业应用前景

                          杨顺楷       四川    成都

1.   引言

   笔者在2015-4-20的精选博文“结核分枝杆菌及工业应用分枝杆菌在甾醇分解代谢的重要研究进展”，概述了作为当代医学顽症结核病肆虐全球，每年导致百万人死亡，尤以非洲和亚洲为甚；与此同时生命科学家也与时俱进，开展了对病原菌结核分枝杆菌的生物医学分子基础，开展了对来自一株土壤放线菌编码的基因簇数据研究，揭示了结核分枝杆菌为何得以在宿主免疫系统的巨噬细胞中顽强存活的新知识。

   另一方面，荷兰学者Van Der Geize 继续在胆固醇分解代谢功能性研究上，开展了对放线菌目的另一个模式菌株红球菌SQ1的3-酮-5a-甾体delta-1-脱氢酶，及其在结核分枝杆菌H37Rv 高度特异性酶类，两者在定向进化同源和种系发生的比较分析研究。

2. 胆固醇分解代谢的分子细胞生物学研究

   首先，作者对红球菌SQ1的酮型甾体脱氢酶D3（kstD3）进行分子克隆，异源表达和酮型甾体脱氢酶D3（3-酮-5a-甾体-delta1位-脱氢酶）的生物化学表征。该酮型甾体脱氢酶D3 基因上游，发现有一类似于delta4位-酮型甾体脱氢酶（3-酮-5a-甾体-delta4位-脱氢酶）的开放读码框，试验性设计为kst4D。

   生物化学分析发现delta1位-酮型甾体脱氢酶D3具有显著的偏好A环饱和3-酮-甾体化合物，呈现出对5a-AD（5a-雄甾烷-3，17-二酮）和5a-T（5a- 睾丸酮，或称17beta位-羟基-5a-雄甾烷-3-酮）的最高活性。但是在C17-位带有较大侧链的5a-甾体没有观察到酮型甾体脱氢酶的活性，但是仅在甾体具有较小側链（5a-孕甾酮）或者是无脂肪侧链（5a-D，5a-T）是该酶的合适底物，二者是新近鉴定出来的饱和甾体化合物代谢途径中间体。

   另一方面，酮型甾体D1 和D2脱氢酶系明星偏好（9a-OH-）4-雄甾烯-3，17-二酮作为底物，即通常胆固醇生物降解产物4-AD和9a-OH-AD，这两种甾体化合物是甾醇和甾体化合物生物降解的中心中间体；与此相反，未曾料想到的是，酮型甾体脱氢酶D3偏好的底物不是4-AD，而是4-AD 的5a-还原型（A环饱和化）作为底物。对已知的和推断的酮型甾体脱氢酶氨基酸序列和种系发生分析表明，可以将红球菌SQ1酮型甾体脱氢酶蛋白家簇归类成为四组，其中引人注目的是D3-酶类，因为它与仅仅存在于结核分枝杆菌H37Rv 的delta1位-酮型甾体脱氢酶同簇，即3-酮甾体脱氢酶Rv3537是病原菌在宿主免疫巨噬细胞中存活的基础。为了分析放线菌目这两株菌在不同簇中不同类型生化表征是否存在酮型甾体脱氢酶类的相似性，将二者的酮型甾体脱氢酶D3进行比较分析研究。

3. 胆固醇降解的基因簇及其红球菌SQ1与结核分枝杆菌H37Rv分离基因簇在胆固醇代谢途径中的同源性

   红球菌SQ1含有甾醇/甾体降解胆固醇基因簇片断有7.4kb 。由此基因作用，提出的代谢途径自胆固醇作为底物起始，启动的数部反应开始断其侧链。经由胆固醇氧化酶（ChoG）和2-烯酰辅酶A水合酶（Hsd4B）催化，生成饱和化的5a-T；以它作为中间体经由Hsd4A催化C17-OH脱氢作用，生成饱和化的5a-AD中间体存在；再经由酮型甾体D3脱氢酶转化成为C1，2-位引入双键的甾体（1-（5a）-AD）；再经由此中间体作为底物，经由delta4-位酮型甾体脱氢酶C4-位脱氢， 成为雄甾C1，4-二烯-3，20-二酮（ADD）；ADD再经由数步反应，最终代谢成为丙酰辅酶A 和丙酮酸。

   类似的考察和基于种系分析表明，两者异源表达Rv3537 酶底物范围几乎与delta 1位-脱氢酶D3一致，发现对其Rv3537病原体酶蛋白和酮型甾体脱氢酶D3存在高度相似的底物范围和表观底物亲和力。这就表明这些就是定向进化同源酶。与推定的结核分枝杆菌H37Rv的3-同型甾体脱氢酶同簇。

   类似的考察在基于种系分析基础上，得出的初步结论说明，在结核分枝杆菌H37Rv 也 仅存在有的酶蛋白delta-酮基甾体脱氢酶，它对于病原菌在巨噬细胞中的存活，伴同的胆固醇分解代谢途径途径起了重要作用。这就提示5a-AT 和/或5a-AD也是与顽症结核菌病原体—结核分枝杆菌相关的重要甾体中间体。

   这类酮型甾体脱氢酶，如D3脱氢酶系，以细菌酶的形式专有性存在，在当今转化医学时代，针对与人体定向进化同源未知的新酶种进行R&D，开拓这一类新药靶标，显然具有应用基础研究的重要性。

4. 与本题相关的生物化学短链脱氢酶/还原酶结构研究知识

   当今短链脱氢酶/还原酶（SDR）已经构成了一组相当数量的功能性异源蛋白家簇。尽管在不同类型之间鉴定为低序列，但是其3D结构呈现高度类似的以beta-片层为中心的alpha/beta折叠模式。基于不同序列基序功能归类是可能构建起一个通用的术语体系。近来突变和结构研究极大地拓展了有关一般反应机理研究知识，从而导致建立起一个“Asn-Ser-Tyr-Lys” 残基催化四联体，该四联体可能形成一个质子依赖系统框架结构，包括烟酰胺核糖的2'-OH，类似于在马肝发现的醇脱氢酶（ADH）。依据其细胞功能，若干个SDR 酶，可能提供作为含SDR酶家簇的氧化还原酶、裂合酶、异构酶的大部分。这类酶中的许多具有不同的底物特异性，如作用于甾体化合物，前列腺素，脂肪醇类和外生化合物。

   例如在红球菌的胆固醇代谢途径中，侧链经由类似beta氧化断侧链，保留甾体母核，经由胆固醇氧化酶（ChoG）和Hsd4B酶系作用，生成饱和化的5a-T，继之转化为5a-AD。这其中的过程就含有SDR对3beta-17beta-羟基甾体脱氢酶的作用。

5. 酮型甾体脱氢酶D3的底物偏好性的见解以及可能在我国藩剑麻麻皂素资源合成甾体激素药物中的应用

   通常甾醇降解得到的有用中间是体4-AD和9-OHAD，然而这两个化合物并不是酮型甾体脱氢酶D3偏好的底物，反而是4-AD 的5a-还原型（A环饱和化）。本文研究结果提示，5a-T 和5a-AD 在对胆固醇分解代谢途径中，是先予ADD（雄甾-1，4-二烯-3，20-二酮）产物的代谢途径中间体。

   通常在C17位带有较大侧链的5a-甾体，没有观察到D3酶对酮型甾体脱氢酶活性，但是仅在甾体具有较小侧链（5a- 孕甾酮），或者是无脂肪酸侧链（5a-AD，5a-T）却是该酶的合适底物；这与酮型甾体脱氢酶D1和 D2不一样，酮型甾体脱氢酶D3不会，或很难与一般的非饱和化的delta 4-位甾体脱氢酶（如4-AD 和9-OHAD）发生脱氢反应；但是也确实观察到了与孕甾酮（4-孕甾烯n-3，20-二酮）的反应活性发生。

   由此提示，借助合成生物学手段，以偶发分枝杆菌、节杆菌或红球菌为底盘细胞，构建起高活力的酮型甾体脱氢酶D3重组菌，实现对A环饱和甾体的生物转化过程。我国已经在南方具有较为丰富的藩麻皂素（云南和四川攀枝花）和剑麻皂素资源（两广福建海南）。该皂素资源化学结构特点是天然产物A环饱和化，经由化学法获得的饱和A环C19或C22酮型甾体作为底物，借助构建的D3酮型甾体脱氢酶重组菌，实现对A环饱和甾体底物的生物转化，获得目标产物A环的delta 1，4-脱氢-3-酮甾体化合物。这也是 国内长期以来开发藩剑麻皂素植物资源，半合成路线合成糖皮质激素（如地塞米松）遇到的瓶颈问题。

6. 预测的R&D结论

   1）应用红球菌和/或偶发分枝杆菌作为底盘细胞，构建起专一性酮型甾体脱氢酶D3酶系，可对经由化学法去藩剑麻皂素侧链，得到的C19，和C22甾体化合物作为底物，实现微生物细胞工厂对饱和化A环的氧化脱氢（C1，4-脱氢-3-酮）生物制造工艺，制得目标甾体中间体。

   2）应用合成生物学途径，构建起高活力的对A环饱和甾体脱氢酶的重组菌株，有可能开发出抗结核杆菌存在于细菌的新型靶向药酶体系，具有在当今转化医学时代抗结核顽症生物技术制药的重大意义。