还有“永生”的DNA链？

摘要

      DNA序列的改变既为生物的演化所必须，又是动物体内癌症发生的主要原因，二者之间必须要有一个平衡。在环境条件相对稳定的情况下，保持DNA序列的稳定对生物的生存更加重要。然而细胞分裂时DNA的复制过程不是100%准确的，而是会有一定程度的误差，这是DNA序列发生变化的重要原因。为了减少DNA复制过程导致的序列变化，生物采取了两种方式。一是减少细胞分裂（也即DNA复制）的次数。多细胞生物利用干细胞来补充需要替换的体细胞，而不是完全通过体细胞自己来分裂繁殖。干细胞进行不对称分裂，形成一个新的干细胞（复制自己）和一个可以进一步繁殖和分化的细胞（用以补充需要替换的体细胞）。把大量的分裂任务交给要进行分化的细胞，就可以大大减少干细胞自身的分裂次数。二是干细胞在进行不对称分裂时，选择性地保留更老的DNA链，而把较新的DNA链（即可能带有DNA复制过程造成序列改变的链）交给要进行分化的，使用后要被丢弃的“子”细胞。通过这种方式，干细胞自身的DNA链就不会因为细胞分裂而改变，这些DNA链也就被一直保留在干细胞内，成为“永生”（immortal）的。选择性地保留永生DNA链的现象叫做DNA链在子细胞中的非随机分配（asymmetric 或者non-random DNA strand segregation），在原核生物中的大肠杆菌和真核生物中的真菌、植物和动物中都被发现，说明这是生物界中的一个普遍现象。干细胞保留的，还不仅是DNA链的“原始文件”，还包括DNA所携带的外遗传修饰（epigenetic modifications），达到保持干细胞自身特性的目的；而进入要进行分化的子细胞中的DNA链由于具有新的外遗传修饰，就可以使子细胞分化成为各种体细胞。干细胞是生殖细胞在多细胞生物身体中的延伸，干细胞选择性地保留永生的DNA链及其外遗传修饰的机制，和生殖细胞保留自己永生的机制一脉相承。

  在上个世纪70年代，英国科学家John Cairns（1922-2018）有一个使他感到困惑的问题，就是癌症发生率和细胞分裂次数之间不相匹配。例如血液细胞、皮肤细胞和小肠绒毛细胞都是生命周期很短，需要被快速替换的细胞，必须有细胞不断分裂来补充它们，这就给DNA序列的变化提供了大量的机会，按理说应该有比较高的几率在这些细胞中发展出癌细胞，但是多数人在一生中并不会患血癌（如白血病）、皮肤癌和小肠癌。 

  其中最令人不解的是小肠绒毛细胞。由于生存在非常恶劣的环境中，包括小肠蠕动引起的机械摩擦，来自消化道上部的各种消化液，以及大量的肠道细菌，这些细胞一般只能存活两、三天，需要不断地得到补充。小肠的长度占整个消化道长度的75%左右，粘膜面积更占消化道的90%，但是小肠癌的发生率却只占消化道癌的1%。

      1963年发现的干细胞（stem cells）给这种现象一种解释。在多细胞生物中，由于许多体细胞（somatic cells，即组成身体的细胞，如皮肤细胞、肌肉细胞、神经细胞，以别于专管繁殖的生殖细胞germ cells）的寿命远低于生物的整体寿命，在生物的各种组织中都存在少数未分化的细胞，即干细胞，它们可以进行不对称分裂，产生两个子细胞，其中一个仍然保留干细胞的性质（自我复制），另一个是将要进行繁殖分化的前体细胞（progenitor cell）。前体细胞一边分裂，一边分化，最后形成数量众多的细胞来替换那些受损的细胞。通过这种方式，干细胞分裂一次就可以形成许多体细胞。由于大量的细胞分裂发生在前体细胞方向上，干细胞自身的分裂次数就可以大大减少了。

  不过干细胞理论还不能使Cairns 满意。由于小肠绒毛细胞替换频繁，即便通过干细胞的分裂来替补它们，据他估计在小鼠的一生中小肠干细胞也要分裂千次以上，这么多次的分裂难道不会积累出足够的DNA序列突变而引起癌症吗？

      Cairns所不知道的是，答案在当时其实已经有了，这就是上个世纪60年代，美国科学家Karl Lark（1930-）发现的细胞分裂时DNA链的非随机分配。

DNA链非随机分配现象的发现

  许多重大的科学发现都是偶然做出的，DNA链非随机分配现象的发现也是如此。

      Lark最初研究的是大肠杆菌T15^-菌株（Escherichia coli T15^-）中DNA的复制状况。在比较差的培养液（以乙酸盐为营养）中，细菌生长缓慢，而且每个细胞只含有一份DNA。当转移到比较好的培养液中（以葡萄糖为营养）时，细菌生长迅速，而且每个细胞含有两份DNA。由于两份DNA是从一份DNA增殖而来，所以这两份DNA是一样的。

  在每份DNA中，一条链是以另一条链为模板，在上一次细胞分裂时合成的，因此这两条链的“辈分”不同。对于新的细胞分裂产生的“子”细胞来说，一条链是“父亲”辈的，另一条是“父亲”辈链的模板，因此是“爷爷”辈的。

  在新一轮细胞分裂时，“父亲”辈的DNA链和“爷爷”辈的DNA链都会分别作为模板，合成新的DNA链。由于碱基配对的原理，DNA双螺旋中的两条链在序列上是互补的，一条链上的碱基G（鸟嘌呤）, 在互补链上对应的是C（胞嘧啶）；一条链上的A（腺嘌呤），在互补链上对应的是T（胸腺嘧啶）。如果我们把“爷爷”辈的DNA链叫做“正链”，把与它互补的“父亲”辈的DNA链叫做“负链”，在DNA复制时，正链作为模板合成负链，负链作为模板合成正链，最后形成的DNA双螺旋又都是由正负两条链组成的双螺旋。两份DNA复制会形成4份DNA，但是由于起模板作用的DNA链的“辈分”不同，待分裂细胞所含的4份DNA在年龄上是不一样的：两份含有“爷爷”辈的DNA链，两份含有“父亲”辈的DNA链。

  “父亲”辈的DNA链是以“爷爷”辈的DNA链为模板合成的，假设DNA的复制过程是100%准确的，以“父亲”辈和“爷爷”辈DNA链为模板合成的新DNA双螺旋，彼此也应该完全相同（如果不考虑端粒部分的序列的话）。即使复制过程有少许错误，即“父亲”辈DNA链的序列不是100%地对应“爷爷”辈DNA链的序列，也有99.99%以上的序列是对应的。在这两种情况下，细胞似乎都不能区别这些新形成的DNA，虽然他们的年龄不同。在细胞分裂时，含有“父亲”辈链的DNA和含有“爷爷”辈链的DNA也应该随机分配到两个“子”细胞中去。

  为了追踪不同辈分DNA的分配情形，Lark用含重氢（3H，即氚）的胸腺嘧啶来标记新合成的DNA链，再让细胞在普通（不含3H）条件下分裂。在这样的细胞分裂中，被3H标记的DNA链又成为模板，但是由于培养液中不再含有3H标记的胸腺嘧啶，新合成的DNA链是不带3H的。这样，对于再下一轮细胞分裂形成的“子”细胞来说，带有3H的DNA链就变成“爷爷”辈的，而以“爷爷”辈DNA链为模板合成的“父亲”辈的DNA链由于不含有3H，以它为模板合成的DNA也应该不含3H。3H是具有放射性的，根据放射显影的结果，就可以知道含“爷爷”辈链的DNA（有放射性）和含“父亲”辈链的DNA（没有放射性）去了哪个“子”细胞里。

  如果细胞分裂时DNA的分配是随机的，则具有两份放射性的细胞、具有一份放射性的细胞和不具放射性的细胞都应该出现，而且数量比例应该按照二项分布（binomial distribution），即25%的“子”细胞含有两份放射性，50%的细胞含有一份放射性，25%的细胞不含放射性。出乎Lark意料的是，所有的子细胞都含有一份放射性！这说明每个“子”细胞都获得了一份含“爷爷”辈链的DNA（有放射性）和一份含“父亲”辈链的DNA（无放射性），证明DNA在“子”细胞中的分配并不是随机的。

  这个结果清楚地表明，大肠杆菌T15^-能够识别DNA的“辈分”，并且据此来分配DNA，虽然这些DNA的序列几乎完全相同。

  由于在原核细胞中观察到的这个结果是Lark没有预料到的，他就想看看在真核细胞中是不是也有类似的情形，而这次他又碰到了好运气。他没有一开始就使用已经建立的哺乳动物的细胞系HeLa（人类宫颈癌细胞）和CHO（仓鼠卵巢细胞），而是使用了他的同事Consigli从小鼠胚胎组织提取的初级细胞（primary cell cultures derived from embryonic tissue）。像在大肠杆菌的实验中那样，他先用含3H的胸腺嘧啶标记细胞分裂时新合成的DNA链，再让这些细胞在无3H的环境中分裂多代，使这些3H标记的DNA链成为“爷爷”辈甚至更高辈，再观察这些带有3H, 也就是带有放射性的DNA链的分配情形。

  在分裂的细胞中，总会有一些细胞核已经分开，而细胞尚未完全分裂的情形，所以其中的两个细胞核就必定是同一个细胞分裂的产物。对这些细胞核的放射显影表明，放射性高度集中在其中一个细胞核内，而另一个细胞核则没有放射性。由于带放射性的DNA链是在多代以前标记的而且具有同样“辈分”，而比它们“辈分”低的DNA链都没有放射性，这说明小鼠的胚胎细胞也能够选择性地分配DNA，把“辈分”高的DNA保留在其中的一个“子”细胞内，而把“辈分”低的DNA分配给另一个“子”细胞。

  小鼠细胞含有20对，即40份DNA，DNA复制后形成80份DNA，放射性集中在一个“子”细胞内的现象说明，在细胞分裂过程中，所有40份带有放射性的（即“爷爷”辈的）DNA都被集中在一起，进入其中的一个“子”细胞，而所有40份没有放射性的（即“父亲”辈的）DNA则进入另一个“子”细胞。这说明小鼠的胚胎细胞也能够识别所有DNA的“辈分”，并且据此来分配DNA。

  这个结果和大肠杆菌中DNA分配的情形不完全一样，但又有共同之处。在大肠杆菌中，“子”细胞同时接收“爷爷”辈和“父亲”辈DNA，而且在每个“子”细胞中都是如此；而在小鼠胚胎细胞中，“爷爷”辈的DNA都集中在一个“子”细胞中，而“父亲”辈的DNA都集中在另一个“子”细胞中，但共同之处是，大肠杆菌和小鼠胚胎细胞都能够识别DNA的年龄，并且据此来分配DNA，也就是在两种情况下，DNA链的分配都不是随机的。大肠杆菌T15^-为什么要把“爷爷”辈的DNA和“父亲”辈的DNA均匀地分配到所有“子”细胞中去，意义还不清楚，但是在动物细胞中，DNA的非随机分配就可以成为干细胞保留辈分较高的DNA的机制。

      Lark再用植物根尖的细胞做实验，也得到了同样的结果。无论是在豆科植物Vicia faba还是在小麦Triticum boeoticum的根尖细胞中，含有“爷爷”辈链的DNA都进入同一个“子”细胞，而含有“父亲”辈链的DNA都进入另一个“子”细胞。

  当Lark再回过头来用HeLa细胞和CHO细胞做实验时，却发现DNA在这些细胞中的分配是随机的，即“子”细胞并不按照DNA的“辈分”来接收DNA。他不知道的是，他之前所使用的小鼠胚胎细胞和植物根尖细胞，正好都富含干细胞，因而观察到了由干细胞的不对称分裂导致的DNA链非随机分配的现象；而HeLa细胞和CHO细胞都不具备干细胞的性质，也不进行非对称分裂，如果Lark一开始就用HeLa和CHO细胞做实验，也许他就会认为DNA的非随机分配不存在于真核细胞中而放弃了。

  虽然Lark做出了DNA链非随机分配的重大发现，他本人却不理解这项发现的意义，更不知道这个现象正是破解Cairns迷惑的关键。再次幸运的是，Cairns对他进行了访问，由此导致了永生DNA链理论的诞生。

永生DNA链理论的诞生

      1972年，Cairns 访问了已经从堪萨斯州立大学转到犹他大学的Lark，其间Lark向Cairns谈起他发现的不同辈分的DNA在细胞分裂时非随机分配的“奇怪”现象。Cairns意识到，这正是他所需要的结果。

      Cairns推论道，如果干细胞在进行不对称分裂时，继续保有干细胞性质的那个“子”细胞保留“辈分”更高（即“爷爷”辈）的DNA链，而让由“父亲”链为模板合成的DNA进入要分化的“子”细胞，到下一轮细胞不对称分裂时，又是保留干细胞性质的“子”细胞继承原来那个“爷爷”辈的DNA链，这样不管干细胞分裂多少次，原来那个“爷爷”辈的DNA链都会一直留在干细胞的后代中，不会有DNA复制产生的序列改变，这就解决了干细胞分裂导致的DNA序列改变的问题。这条“爷爷”辈的DNA链由于在细胞分裂过程中一直被保留，也就成为“永生”（immortal）的。在这里，我们在给永生二字加上了引号，其中原因，我们在文章的最后一部分中再谈。

  带有序列变异的“父亲”辈链的DNA进入要进行分化的前体细胞（progenitor cells），前体细胞一边繁殖，一边分化，最后形成新的体细胞，用以替换受损的老细胞。每次细胞分裂都会造成一些DNA序列的变化，但是这已经和干细胞无关了，而且这些变异的DNA最终也和被替换的细胞一起被丢弃，不会影响干细胞的DNA。这真是一个非常“聪明”的减少癌症发生率的方法。

  这有些像文件复印，复印机是不可能完全保持原始文件的质量的，每复印一次，复印件的质量就会差一点，相当于DNA序列由于复制过程有些改变。如果每次都用最后的那份复印件进行复印，质量就会越来越差。但是如果保留原件，每次复印时都用原件，复印件的质量就会比较高了，而且原件的质量也不会随着复印次数增加而变差。干细胞就有保留“原始文件”的本事，小肠绒毛干细胞由于一直保留DNA链的“原件”，因此不会积累细胞分裂造成的DNA序列改变，这就给小肠癌的低发生率一个完美的解释。

  在这些想法的基础上，Cairns在1975年提出了他著名的“永生DNA链假说”（Immortal strand hypothesis），文章题目为Mutation selection and the natural history of cancer，发表于《自然》(Nature) 杂志上。

  这真是一个破天荒的想法，干细胞居然能够识别DNA的年龄，并且根据“子”细胞的命运（是继续成为干细胞还是繁殖分化成为体细胞），决定接收哪个年龄的DNA。文章发表后，引起了一些人的兴趣，开始进行这方面的研究，但是也有许多人觉得难以置信：干细胞还能有这本事？Lark观察到的现象会不会是实验过程造成的假象（artifact）或者解释错误？细胞是怎么识别DNA的年龄的？即使能够识别，又如何根据年龄把它们有选择地分配到“子”细胞中去？

  有一个说法，叫做“非同寻常的结论需要非同寻常的证据”（Extraordinary conclusion requires extraordinary evidence）。Cairns的假说是如此非同寻常，自然需要通过各种方式严格加以检验。随后一系列的实验证明，干细胞真有保留“原始文件”的本事。

多种生物组织中存在少数能够长期保留被标记的DNA链的细胞

  为了证明干细胞能够保留“永生”的DNA链，Cairns与研究上皮细胞更新的英国科学家Christopher Potten （1940-2012）合作，研究了他最感兴趣的小肠干细胞。他们在干细胞形成的阶段用3H-胸腺嘧啶标记DNA，4个星期后再观察小肠绒毛细胞中具有放射性的DNA的分布情形。结果发现，绝大多数小肠绒毛细胞都随机分配不同年龄的DNA，因此随着细胞分裂次数的增加，具有放射性的DNA由于随机分配而不断被“稀释”，所以这些小肠绒毛细胞的放射性强度已经很低。但是在隐窝（crepts，小肠绒毛之间的凹陷处）深处，从底部往上算起第4位上有1-5个细胞放射性强度很高，与DNA刚被标记时相当。而第4位正好是小肠干细胞所在的位置，所以很可能是小肠干细胞在一直保留干细胞刚形成时被标记的DNA链。用同样的方法，Potten和Cairns在舌头味蕾基部（也是干细胞所在的位置）发现了少数保留放射性DNA的细胞。这些结果于1978年发表于《细胞》（Cell）杂志上，支持Cairns提出的组织中少量干细胞选择性地保留“永生”DNA链的假说。

  其实在1975年Cairns提出他的“永生”DNA链假说之前，就已经有人用DNA标记法来在组织中寻找干细胞了。例如在1968年，以色列希伯莱大学（Hebrew University）的科学家用3H腺嘌呤标记真菌（Aspergillus nidulans，属于子囊菌）从分生孢子生长出来的菌丝，再观察菌丝中各个细胞核中放射性保留的情形。真菌菌丝生长时，DNA的复制并不导致细胞分裂，而是形成多细胞核的菌丝，细胞核在菌丝中大体上均匀排列。在菌丝生长的过程中，多数细胞核的放射性强度不断降低，说明在这些细胞核形成时，DNA是随机分配的。但是在靠近菌丝顶端的位置上，有两个细胞核始终保持原来的放射性强度，说明这两个细胞核能够一直保留最初被标记的DNA链。这个结果表明，除动物和植物外，真菌在进行细胞核分裂时，也能选择性地保留原始的DNA链。

      2004年，Potten扩展了他对小鼠组织的实验，进一步观察小鼠的皮肤和毛囊是否如小肠绒毛那样也含有能够长期保留标记DNA链的细胞。像1966年的实验一样，他用3H胸腺嘧啶标记小鼠新形成的组织，再在3-12个星期后检查小鼠的皮肤和毛囊，结果发现在两种组织中都有少数能够长期保留放射性的细胞。在小鼠的皮肤中，干细胞位于上皮基部，干细胞分裂分化形成的上皮细胞组成六角形的柱状，细胞从干细胞的位置不断向外移动，取代最外面被淘汰的上皮细胞。而保有放射性的细胞就正好位于这些细胞柱的底部，说明它们很可能是干细胞。在小鼠的毛囊根部，也有1-2个保留放射性的细胞，其位置也符合其他研究所揭示的毛囊干细胞的存在处。

      2007年，美国农业部乳牛实验室的Anthony Capuco出于对Cairns假说的兴趣，想知道奶牛乳腺中是否也有能够保留永生DNA链的干细胞。他没有使用3H胸腺嘧啶，而是使用5-溴代脱氧尿苷（5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU）来标记2个月大的小乳牛的乳腺。尿嘧啶（Uracile）上第5位的氢原子被溴原子取代以后，在结构上就类似于胸腺嘧啶（在第5位有一个甲基），在与脱氧核糖相连后形成5-溴代脱氧尿苷，可以作为胸苷（胸腺嘧啶和脱氧核糖组成的化合物）的类似物在DNA复制时组入新形成的DNA链。BrdU没有放射性，所以不能使用放射性显影的方法进行追踪，但是可以通过针对BrdU的抗体用免疫染色法进行观察。在最后一次标记的5个星期后，乳牛的乳腺组织被收集固定并且切片，再用免疫染色法观察被BrdU标记的DNA，发现绝大多数乳腺细胞只被轻微染色，但是在乳腺池（gland cistern，收集乳汁的地方）周围有少数细胞被强烈染色，指示这些细胞保留了被BrdU标记的DNA。

  以上这些细胞都能够长时期地保留标记的DNA链，因而被称之为“标记保留细胞”（Label retaining cells, LRCs）。它们在数量上远少于组织中的其他细胞，其位置也符合用其它方法决定的干细胞的位置，与Cairns关于干细胞能够选择性地保留“永生”的DNA链的说法一致。这样的细胞在动物、植物和真菌中都被发现，说明这是一个在生物界普遍存在的现象。

  但是这些结果还不能证明这些细胞就是干细胞。如果在被标记之后有少数细胞出于某种原因不再分裂，这些细胞也能够保留被标记的DNA链。而干细胞的任务是补充要被替换的体细胞，是必须进行分裂的。如果能够证明这些保留标记DNA链的细胞也在不断分裂，那就可以为这些细胞是干细胞的结论提供更有说服力的证据。

双标记法证明标记保留细胞确实在分裂

      2002年，为了证明小肠绒毛中保留被标记的DNA链的细胞确实在分裂，除了用3H胸腺嘧啶标记DNA链外，Potten还用BrdU标记以含3H的DNA链（爷爷辈的）为模板合成的DNA链（父亲辈的）。在BrdU标记后的第一天，90%以上的小肠绒毛隐窝第4位的细胞都被3H和BrdU同时标记，说明这些细胞在被3H标记后都进行过细胞分裂（这样BrdU才能组入新合成的DNA链）。在往后的日子中，第4位的细胞一直保留3H标记，而BrdU的信号却逐渐下降，到第8天时信号强度只余下3%。如果第4位的细胞不分裂，3H和BrdU的信号都应该一直被保留，而如果细胞分裂时DNA的分配是随机的，3H的信号和BrdU的信号都应该同时被稀释而不断降低。实际观察到的3H信号强度保留不变，而BrdU信号不断降低的事实说明，这些细胞在不断地进行不对称分裂，继续作为干细胞的“子”细胞保留了被3H标记的，因而是“辈分”较高的DNA链，而被BrdU标记的“父亲”辈DNA链则被分配到要进行分化的“子”细胞中去，通过其后的对称分裂而逐渐被稀释。这是对小肠干细胞进行不对称分裂，选择性地保留“爷爷”辈DNA链最强有力的证据。

      2005年，美国癌症研究所的Gilbert Smith 用同样的双标记法来研究小鼠的乳腺干细胞。也观察到被3H标记的细胞能够被BrdU标记，形成双标记的细胞。随着时间推移，BrdU的信号逐渐进入周围的组织，而3H的信号强度保持不变，证明乳腺干细胞也在活跃地进行分裂，并且能够选择性地保留被3H标记的DNA链。

      2005年，加拿大多伦多大学（University of Toronto）和滑铁卢大学（University of Waterloo）的科学家用BrdU标记从小鼠脑中提取到的神经干细胞。为了观察这些细胞的分裂情形，科学家们在用BrdU标记干细胞后，又立即用荧光染料Dil（1-Dioctadecyl-3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）来标记这些干细胞。细胞分裂时，这些荧光染料会被分配到后代细胞中去，浓度不断被稀释。从细胞中Dil发出的荧光强度，就可以知道细胞的分裂的活跃情形。在培养皿中，这些双重标记的干细胞会形成细胞团，其中多数是已经分化的神经细胞和胶质细胞的前体细胞，但是也保留了少数干细胞。多数细胞的荧光强度和BrdU信号强度都很低，说明这些细胞进行了多次对称分裂，信号被稀释了。但是在低Dil荧光强度的细胞中，有大约1%的细胞保留了高的BrdU信号强度，说明这些是活跃地进行分裂，但是又保留较老DNA链的干细胞。

  这些实验结果都表明，动物组织中那少数保留辈分高的DNA链的细胞确实在进行不断的细胞分裂，进一步支持这些细胞是干细胞的想法。

  不过这些实验还没有证明保留辈分高的DNA链的细胞真的具有干细胞的特征，而继承辈分低的DNA链的细胞真的是要进行分化的细胞。随着干细胞研究的进展，这个问题也被解决了。

保留高辈分DNA链的细胞具有干细胞的特征

      2007年，美国斯坦福大学Thomas Rando的实验室用氯代尿苷（CldU）和碘代尿苷（IdU）来标记小鼠的肌肉干细胞。与以前其它实验室在标记后让细胞分裂多代，以提高被标记的DNA链的“辈分”的做法不同，他在双重标记后立即观察DNA链的分配情形。这样，用CldU标记的在干细胞第一轮细胞分裂时新形成的DNA链就是“父亲”辈的，干细胞原来的DNA链就是“爷爷”辈的，不会被标记。在第二轮细胞分裂时，他用碘代尿苷标记“儿子”辈的DNA链。标记后的细胞被分开为单个细胞培养，让细胞完成第二轮分裂。为了更好地追踪细胞第二轮分裂的情形，Rando在培养基中加入了细胞松弛素（cytochalasin D）。细胞松弛素不影响细胞核的分裂，但是能够干扰肌纤蛋白（actin）的聚合过程，使分裂形成的两个“子”细胞不能完全彼此分开，形成细胞对，这样就可以确定这两个细胞是来自同一个干细胞。对这些细胞对进行CldU和IdU免疫染色的结果表明，所有的“子”细胞都含有IdU的染色，但是CldU染色只集中在其中的一个“子”细胞中。由于CldU标记的是“父亲”辈的DNA链，不显示CldU染色的细胞应该含有没有被CldU标记，也就是“爷爷”辈的DNA链。那么是哪一个“子”细胞仍然保留干细胞的特性，哪一个“子”细胞会进行细胞分化呢？

  在这里，Rando利用“肌间线蛋白”（Desmin）来区分两个“子”细胞。由于要分化为肌肉细胞的那个“子”细胞会表达Desmin，而继续保留为干细胞的那个“子”细胞不会表达Desmin，看看Desmin在哪个“子”细胞中表达，就可以知道哪一个是干细胞，哪一个是要分化的细胞了。

  实验结果表明，继承CldU标记的“子”细胞表达Desmin，而不继承CldU的“子”细胞不表达Desmin，这就清楚地表明继承“爷爷”辈DNA链的“子”细胞继续为干细胞，而继承“父亲”辈DNA链的“子”细胞是要进行分化的细胞。

  除了用Desmin来识别要进行分化的细胞，Rando 还用转录因子（transcription factor，结合在基因的启动子上，控制基因开关的蛋白质）Sca-1来分辨“子”细胞。Sca-1只在干细胞中表达，而不在要分化的细胞中表达，而且Sca-1和Desmin之间还有拮抗关系，表达Desmin的细胞不表达Sca-1, 表达Sca-1的细胞不表达Desmin。Sca-1在“子”细胞中的表达状况表明，保留“爷爷”辈DNA链的“子”细胞表达Sca-1，而继承“父亲”辈DNA链的“子”细胞不表达Sca-1，进一步证明继承“爷爷”辈DNA链的“子”细胞继续为干细胞。

      2006年, 法国巴斯德研究所Vasily Shinin 的实验室用Numb蛋白来标记小鼠的肌肉干细胞。Numb是控制细胞非对称分裂的重要蛋白质，在细胞分裂时会通过与PAR复合物（决定细胞极性，即不对称性的蛋白复合物之一）之间的相互作用保留在继续成为干细胞的“子”细胞中。为了研究DNA的非随机分配与干细胞之间的关系，Shinin用BrdU标记小鼠的肌肉细胞，再让这些细胞在无BrdU的环境中培养。在4个星期以后，只有少数细胞仍然保留有BrdU的信号。对这些细胞进行Numb蛋白的免疫染色表明，这些保留BrdU信号，因而保留有高辈分DNA链的细胞，也含有高浓度的Numb蛋白，而具有低BrdU信号的细胞则测不到Numb蛋白，这是标记保留细胞为干细胞想法的又一个有力证据。

  另一个干细胞标记物就是细胞表面的一种受体Lgr5（Leucine-rich G protein-coupled receptor 5），属于与G蛋白偶连的受体，在小肠、直肠和毛囊干细胞中都有表达。2011年，美国波士顿生物医学研究所（Boston Biomedical Research Institute）James Sherley的实验室用Lgr5来研究DNA链的非随机分配和干细胞之间的关系。Sherley提取了小鼠毛囊的干细胞，用BrdU标记DNA，再让这些细胞在无BrdU，但是含有细胞松弛素的培养基上进行分裂，这样由同一个干细胞分裂形成的两个细胞也彼此相连，可以研究标记的DNA链和Lgr5在两个相邻的细胞核中的分配情形。实验结果表明，Lgr5总是和BrdU标记的DNA链在同一个细胞核，证明保留年龄大的DNA链的毛囊细胞真的是干细胞。

  以上实验表明，动物组织中的确存在少数不断进行分裂，而又能保留DNA（原始文件）的细胞，而且这些细胞还表达干细胞的标记物（Sca-1、Numb和Lgr5），或者不表达要分化细胞的标记物（Desmin），证明这些细胞确实是干细胞。

  不过对于这些结果，有些人还不完全满意。证明干细胞保留“永生”DNA链，用的都是直接标记DNA链的这一类方法（用3H胸腺嘧啶或者卤代尿苷），如果还有其它方法也能证明这一点，Cairns的理论就会更加令人信服。两个设计巧妙的实验，还真的做到了这一点。

用不同的方法证明干细胞选择性地保留永生DNA链

      2006年，美国国立癌症研究所的Amar Klar （注意不要和DNA非随机分配的发现者Lark相混）发明了一种新的方法来研究细胞分裂时DNA的分配方式。这个方法比较复杂，需要比较详细地加以介绍。

  小鼠胚胎干细胞含有两份第7号染色体（DNA），一份来自父亲，一份来自母亲。每份DNA中的两条链的“辈分”不同。在上一次DNA复制时作为模板的链辈分较高，用字母W表示，以W为模板合成的DNA链辈分较低，用C表示（W和C分别来自DNA双螺旋的发现者Watson和Crick的名字）。所以来自父亲的DNA为“父W父C”，来自母亲的DNA为“母W母C”。在新一轮细胞分裂中，每一条DNA链都会作为模板，合成新的DNA链，4条DNA链就会形成4份DNA。如果新合成的链用小写字母表示，就分别是“父W父c”，“父w父C”，“母W母c”和“母w母C”。

  在细胞分裂前，Klar在小鼠的两份第7号染色体（DNA）上分别引入次黄嘌呤磷酸基转移酶基因（hypoxanthine phosphoribosyl transferase，HPRT）的上半部分和下半部分。DNA复制后，“父w父C”和“母W母c”这两份DNA之间在细胞分裂前发生同源重组（homologous recombination，即DNA分子之间进行片段交换），两个半份基因组在其中一份DNA中合成一个完整的HPRT基因，在另一份DNA中则不会形成HPRT基因。这样，DNA复制形成的4份DNA分别是：“父W父c”、HPRT（+）、HPRT（-）和“母w母C”。

  当完成同源重组的细胞在选择性的培养基中生长时，只有含有HPRT（+）DNA的细胞能够生存下来。如果DNA的分配是随机的，HPRT（+）既可以和“父W父c”进入同一个“子”细胞，也能够和“母w母C”进入同一个“子”细胞；而如果DNA的分配是非随机的，则HPRT（+）只能和其中之一进入同一个细胞。如何区分这两种情形呢？

  在这里，Klar利用了来自父亲和母亲的DNA上一个基因启动子上甲基化状况的不同来区别它们，一个在SacII酶切点（CCGCGG）上带有甲基，另一个不带。带有甲基的SacII酶切点被屏蔽，不能被酶切开，在用TagI/SacII双酶切DNA时，就会切出不同长度的片段来。比较切出的DNA片段的长度，就可以知道是“父W父c”还是“母w母C”。

  在检查了100个“子”细胞后，Klar发现，与HPRT（+）一起进入这些细胞的，全部是“父W父c”，没有一个“子”细胞含有“母w母C”，即这些细胞都含有较高辈分的DNA。这个结果证明，小鼠的胚胎干细胞的确能够选择性地保留辈分较高的DNA。

  当Klar用小鼠的心肌细胞和胰腺细胞进行同样的实验时，却发现这两种细胞并不能选择性地保留辈分较高的DNA。在含有HPRT（+）的细胞中，大约有一半含有“父W父c”，另一半含有“母w母C”，说明选择性分配DNA的能力不是方法本身带来的假象，而是干细胞本身的能力。

      2010年，加拿大不列顛哥倫比亞大學（University of British Columbia）的Peter Lansdorp与其他加拿大科学家合作，发明了又一种研究DNA分配状况的方法。他们发现，在每份DNA靠近端粒（telomere）的地方，有许多方向一致的重复序列。这些重复序列在不同的DNA之间相同，而在同一DNA的两端不同。由于DNA中两条链的互补性质，模板链上的重复序列就和新生链上的序列不同。例如在模板链W上的重复序列为5’-GACGTGGAATATGGCAAG-3’, 在新合成的链C上序列就是3’-GTTGCCATATTCCACGTC-5’。前者作为探针可以标记新合成的链，而用后者作为探针可以标记模板链。

  不过这样的探针还不能直接使用，因为在新一轮细胞分裂过程中，W链为模板会合成“儿子”辈的c链，C链也会成为模板合成“儿子”辈的w链。由于“爷爷”辈的W链和“儿子”辈的w链的序列，包括重复序列，几乎完全相同，探针是无法区别它们的。要观察W链和C链在“子”细胞的分布情形，就必须把“儿子”辈的w链和c链除去。

      Lansdorp的方法是用BrdU来标记新合成的“儿子”辈的DNA链，用紫外线照射，在含有BrdU的DNA链上形成许多断裂处，再用核酸外切酶III（Exonuclease III）将新链水解掉。这样在细胞中剩下的就只有“爷爷”辈的W链和“父亲”辈的C链了，就可以用针对它们的探针来观察它们的分布情形。

  观察结果表明，在小鼠直肠干细胞分裂后，“爷爷”辈的W链集中于一个“子”细胞，而
“父亲”辈的C链集中于另一个“子”细胞，证明这些干细胞能够选择性地将辈分高的DNA链保留在其中一个“子”细胞中。

  到此，通过科学家多年的努力， Cairns在1975年提出的“永生”DNA链的理论，可以说是得到完全的证实。

      Cairns当初提出这个理论时，考虑的主要是DNA序列改变与癌症发生率之间的关系，把干细胞选择性地保留“永生”的DNA链看作是减少DNA复制过程导致的序列改变的手段。但是随后的科学研究结果表明，干细胞选择性保留的，并不只是DNA序列的“原始文件”，还包括与高辈分DNA链相联系的，序列以外的特性，叫做“外遗传修饰”（epigenetic modifications），它们在“子”细胞的命运（是继续保持为干细胞还是分化为体细胞）的决定上起重要作用。

干细胞选择性地保留的，还有DNA的外遗传修饰

  细胞的命运和性质归根结底是由基因的表达状况决定的。动物体内所有的细胞都含有完全相同的DNA，之所以有些细胞成为未分化或者分化程度低的干细胞，有些细胞成为组成身体的各种体细胞，就是因为这些细胞中基因表达的情形不一样。不同的基因表达生成不同的蛋白质，执行不同的功能，使得每种细胞都有自己的特性。

  在这方面，保留DNA“原始文件”中核苷酸的序列无疑非常重要的，它保证基因表达的产物，蛋白质中氨基酸的序列保持不变，也保证基因“开关”的序列保持不变。但是影响基因表达状况的，不仅是DNA的核苷酸序列，还有DNA序列中碱基被修饰的状况和与DNA结合的蛋白质被修饰的状况。这些修饰发生在核苷酸的序列之外，叫做“外遗传修饰”（epigenetic modifications），其中的“epi-”就是“上”和“外”的意思，国内译为“表观遗传修饰”。

      DNA序列中碱基的修饰主要是在一些胞嘧啶（cytosine）的5位上加上一个甲基（-CH₃），叫做DNA的“甲基化”（methylation），其作用主要是屏蔽基因的启动子，使其不能发挥功能。基因的启动子（promoter）也是DNA序列，通过结合转录因子（transcription factors，控制基因开关的蛋白质）发挥作用。不同的转录因子有不同的结合序列，例如转录因子AP-1的结合序列为5’-TGACTCA-3’，转录因子SP1的结合序列为5’-CCCGGG-3’上。不同基因的启动子含有不同的转录因子的结合序列，使得每种基因在细胞中都有自己独特的表达方式。胞嘧啶的甲基化，相当于是给这个碱基戴了顶“帽子”，使得转录因子“不认识”原来的结合序列了，基因表达也会受到影响。启动子区域胞嘧啶的甲基化一般都和基因的表达程度降低有关。

  除了胞嘧啶的甲基化，胞嘧啶还可以被羟甲基化，即在胞嘧啶上加上一个羟甲基（HOCH₂-），其功能主要是控制DNA的甲基化程度。

  外遗传修饰的第二种类型是对组蛋白加以修饰，其中又包括多种形式，例如甲基化、乙酰化和磷酸化。真核细胞中的DNA并不是裸露的，而是和组蛋白（histones）结合，组成“染色质”（chromatid）。与DNA结合的组蛋白主要有4种，分别是H2A、H2B、H3和H4，它们在一起组成球形的8聚体，其中每种组蛋白有两个分子。在细胞分裂时，染色质高度浓缩，才成为在显微镜上容易看到的“染色体”（chromosome）。所以我们在前面谈到的细胞分裂时DNA的分配，其实是分裂期染色体的分配，分配的不仅是DNA，还有与之结合的组蛋白及其修饰状态。

  组蛋白的修饰状态对基因表达也有很大的影响。如果染色质的一部分是紧密包裹的，这部分的DNA就被“隐藏”起来，转录因子无法与启动子结合，基因也无法表达了。使染色质松弛的一种手段就是组蛋白的乙酰化，在赖氨酸侧链的氨基（-NH₃⁺）上加上乙酰基（CH₃CHO-）。氨基在中性pH下是带正电的，有助于组蛋白与带负电的DNA结合。在氨基上加上乙酰基，相当于是“屏蔽”了氨基所带的正电，使得组蛋白与DNA的结合变得不那么紧密，染色质散开， DNA链暴露出来，转录因子和RNA聚合酶就可以结合到基因上，启动基因的表达了。

  除了组蛋白的乙酰化，组蛋白中侧链上的赖氨酸和精氨酸上的氨基还可以被甲基化，而且在氨基上还可以加上不止一个甲基。这些被甲基化的氨基多数成为其它蛋白或蛋白复合物的“招募”点，使他们参与染色质有关的各种活动，例如组蛋白4（H4）第20位的赖氨酸加上一个甲基（H3K4me1，其中K代表赖氨酸，me代表甲基methyl，1表示加上一个甲基）使染色质包裹紧密，抑制基因表达，在同一个氨基上加上两个甲基（H3K20me2）与DNA损伤的修复有关，而在H3第4位的赖氨酸上加上2个或3个甲基（H3K4me2和H3K4me3）就与基因的活化有关。

  组蛋白中丝氨酸（serine）缬氨酸（threonine）和酪氨酸（tyrosine）上的羟基（-OH）上还可以加上一个磷酸根，叫做组蛋白的磷酸化（histone phosphorylation）。和甲基化的赖氨酸和精氨酸的作用类似，这些磷酸化的氨基酸也作为其他蛋白的招募点，参与和染色质有关的各种活动。例如H2第32位的丝氨酸的磷酸化（H2S32ph，其中S代表丝氨酸，ph代表磷酸根）就与上皮生长因子（EGF）基因的表达有关，H3S10ph和H2BS32ph就与c-fos、c-jun和c-myc等基因的表达有关。

  干细胞和体细胞在组蛋白的修饰上各有特点，因此干细胞所保留的高辈分的DNA，其实也包括了这份DNA的甲基化状况和与之结合的组蛋白的修饰状况。由于细胞的特性是由基因表达状况决定的，保留干细胞原来的外遗传修饰，也就保留了干细胞的特性。

  例如在2013年，前面提到过的美国波士顿生物医学研究所的James Sherley用BrdU标记小鼠毛囊细胞，在96小时（大约4-5次细胞分裂）后用免疫荧光染色法检查甲基化胞嘧啶和羟甲基化胞嘧啶的含量，发现保留BrdU信号的细胞，即毛囊干细胞，富含羟甲基化的胞嘧啶，而细胞对中的另一个细胞（即要进行分化的细胞）含有很少的BrdU信号和羟甲基化的胞嘧啶。甲基化的胞嘧啶的含量在两个细胞核中的含量则差别不大，说明含“永生”DNA链的染色质富含羟甲基化的胞嘧啶。

      2015年，Sherley的实验室用类似的方法（BrdU和免疫荧光染色），比较了小鼠毛囊干细胞分裂时两个“子”细胞中组蛋白H2A的一个变种，H2A.Z的存在情形，发现在保有永生DNA链的“子”细胞中，H2A.Z很容易被探测到，但是在要分化的细胞中却探测不到。在细胞用盐酸处理后，在两个细胞中都能够探测到H2A.Z，说明在含永生DNA链的染色体上，H2A.Z蛋白是暴露的，而在要分化的细胞中是被屏蔽的。这些结果说明，在干细胞不对称分裂形成的两个“子”细胞中，组蛋白H2A.Z的存在状况是不一样的。

      Sherley的实验室还研究了小鼠毛囊干细胞分裂时组蛋白H3的甲基化状态在“子”细胞中的分布情形。在2014年发表的一篇文章中，他们发现组蛋白H3第4位和第27位的赖氨酸被三个甲基修饰（分别为H3K4me3和H3K27me3 ）的程度在保留干细胞特性的“子”细胞中要高得多，可以作为这些干细胞的标志。

      2012年，美国约翰·霍普金斯大学（Johns Hopkins University）Xin Chen 的实验室用不同颜色的荧光蛋白来分别标记果蝇雄性生殖干细胞中辈分较高的和新合成的组蛋白H3，再观察干细胞不对称分裂后H3在“子”细胞中的分布情形，发现保留干细胞特性的“子”细胞继承了原来的组蛋白H3，而新合成的H3组蛋白则进入要进行分化的“子”细胞。不仅如此，原来的组蛋白H3第3位的缬氨酸是被磷酸化的（H3T3ph），而新合成的H3第3位的缬氨酸没有被磷酸化。

  这些结果都说明，干细胞在进行不对称分裂时，不仅保留了辈分大的DNA链，还继承了与其相连的外遗传修饰。这些修饰不仅能够使继承它们的“子”细胞保持干细胞的身份，也为干细胞分裂时染色体的不对称分配提供依据。

外遗传修饰可能是细胞识别DNA年龄的标志

  要细胞识别DNA的年龄，并且以此来决定不同年龄的DNA在“子”细胞中的分配方式，初看起来似乎是不可能的事情。以“永生”DNA链为模板合成的DNA链携带的信息极为相似，核苷酸序列99.9%以上互补，而且DNA复制时在新合成链上产生的错误是随机的，细胞不可能提前“知道”，也就无法发展出根据这少量序列的差别来选择性地分配DNA的机制。要更好地理解这个问题，就需要知道细胞分裂时DNA是如何分配到两个“子”细胞中去的。

  在真核生物的细胞分裂时，细胞中的两个彼此分开的中心粒（centrosome）向对方发出由微管（microtube）组成的细丝，它们的走向类似地球仪上的经线，组成的结构又像一个纺锤，所以又叫做“纺锤体”（spindle）。DNA复制后，生成的两份相同的DNA通过它们的“着丝点”（centromere，注意不要和中心粒centrosome想混）彼此连接在一起。着丝点本身也是DNA的一部分，上面再结合许多蛋白质分子组成。着丝点将DNA分为“短臂”和“长臂”，通过着丝点连接的两个染色体看上去就像字母X的形状，也就是大家熟悉的染色体的样子。

  在细胞分配染色体时，所有的染色体都运动到纺锤体中部的一个面上。这个面类似于地球的赤道面，所以被称为赤道面（equatorial plane）。在赤道面上，通过着丝点连在一起的两份DNA各自用自己的着丝点分别与纺锤体两端的中心粒发出的微管相连。微管收缩，就把两份DNA“拉”向不同的中心粒，这两份DNA就彼此分开了，在细胞分裂时进入不同细胞的细胞核。这个过程叫做“有丝分裂”（mitosis）。

  如果在有丝分裂过程中分开的只是DNA，细胞是无法分辨两份DNA的年龄的，因为它们之间的核苷酸序列几乎完全相同。但是DNA并不是裸露的，而是和组蛋白组成染色质，在细胞分裂时形成染色体。如果与不同年龄DNA结合的组蛋白修饰状况不同，细胞就可以根据这些差别判断DNA的年龄，不对称分配就变得可能了。

  这有些像人身上穿的衣服。模板DNA和新合成的DNA就像双胞胎兄弟，穿同样的衣服，他们之间的差别就极小，几乎无法辨别。但是如果在双胞胎兄弟穿的衣服上做出改变，例如配戴上不同的徽章，就容易区分他们了。组蛋白的修饰，例如前面谈到的组蛋白的乙酰化、甲基化、和磷酸化，就相当于是在衣服上佩戴各种徽章，细胞也就可以识别它们了。

  要选择性地分配DNA（染色体），只有染色体之间的差别还不够，纺锤体中的两个中心粒也需要有区别，这样辈分高的DNA才“知道”与哪个中心粒相连，从而进入特定的“子”细胞。实际的情形也的确如此：细胞分裂时，每个“子”细胞只接收1个中心粒，在下一次细胞分裂前，这个中心粒进行复制，形成两个中心粒，所以两个中心粒的“辈分”不同，类似于模板DNA链和新合成DNA链的辈分。这两个辈分不同的中心粒所结合蛋白质（例如Ninein和Cenexin）的情形也不同，这样不同的中心粒就可以和不同辈分的染色体相互识别，进而通过微管相连，不同年龄的DNA就可以有选择性地进入命运不同的“子”细胞了。

细胞进行对称分裂和不对称分裂的控制机制

  在动物体内，细胞的不对称分裂和DNA的选择性分配只是干细胞特有的功能，一旦成为体细胞的前体细胞，再进而繁殖分化成为体细胞，这个功能就消失了，细胞改而进行对称分裂。这里面一定有控制机制，决定细胞的分裂是对称的还是不对称的。

  在胚胎发育过程中，一个受精卵细胞要形成由数量极其庞大的细胞组成的生物体，在开始阶段也是进行对称分裂，以增加干细胞的数量。例如从受精卵（可以看成是全能干细胞）形成囊胚期的内细胞团中，每一个细胞都是胚胎干细胞，在适当的条件下都可以发育成为一个完整的生物体，这些内细胞团的细胞也是通过对称分裂形成的。只有身体逐渐发育成熟，在每种组织中形成成体干细胞后，这些干细胞才开始不对称分裂，以补充不断消耗的体细胞。从发育期干细胞的对称分裂转变为不对称分裂，其间也一定有一个转换机制。

  而且即使是成体干细胞也不总是进行不对称分裂。不对称分裂只是在需要干细胞补充体细胞时才发生。干细胞除了不对称分裂，也进行对称分裂，分裂形成的两个“子”细胞都是干细胞，以弥补由各种原因引起的干细胞数量的下降。这里面也一定有一个控制机制。

  然而要弄清这个机制是非常困难的事情。细胞进行有丝分裂的过程极为复杂，控制因素非常多。要从中找出启动非对称分裂的因素，目前还是一个难以实现的目标，但是近年来的科学研究已经提供了一些有趣的线索，表明细胞的不对称分裂与以下因素有关：

DNA的甲基化

  在上一节中，我们谈到“永生”DNA链含有较多的羟甲基化的胞嘧啶。2013年，美国加州大学伯克利分校（UC Berkeley）Michael Conboy的实验室表明，小鼠胚胎干细胞的不对称分裂需要DNA的甲基化。如果敲除甲基化酶Dnmt3 (DNA methyltransferase-3)，这些细胞就不再进行不对称分裂。

      DNA的甲基化状况与组蛋白的修饰密切相关，因此这个结果无法区分细胞在不对称分裂的过程中，依靠的是DNA的甲基化状况，还是组蛋白的修饰状况。

蛋白p53

  成体干细胞在体外培养时非常难以扩张，因为它们总是进行非对称分裂。每个干细胞分裂时只产生一个干细胞，另一个是要进行分化的体细胞的前体细胞。前体细胞繁殖分化，形成大量的体细胞。这样，干细胞的数量并不会随着细胞分裂而不断增加，其浓度反而会随着培养时间延长体细胞的大量形成而不断被稀释，最后丧失干细胞系。

  前面提到过的，美国波士顿生物医学研究所的James Sherley发现，如果在干细胞中让蛋白p53恢复表达，干细胞就会进行对称分裂，形成的后代细胞也都是干细胞，这就解决了在体外增殖成体干细胞的问题。

      p53是一种抗肿瘤蛋白，在DNA被损伤到一定程度时会阻止细胞进行分裂，防止这些细胞繁殖为癌细胞。p53的一个信号传递链就是抑制磷酸次黄嘌呤脱氢酶（IMPDH）的活性，阻止它将黄嘌呤核甘（xanthosine）代谢掉。因此在干细胞培养液中直接加入黄嘌呤核苷也能够让干细胞从不对称分裂变为对称分裂，达到干细胞增殖的目的。

蛋白激酶Pim-1

      Pim-1是一个蛋白激酶，能够在其它蛋白质分子的丝氨酸和苏氨酸残基的侧链上加上磷酸根。在细胞进行有丝分裂时，Pim-1位于纺锤体的两极，磷酸化与微管结合的蛋白NuMA，还与若干与有丝分裂有关的蛋白质相互作用，包括与着丝点结合的蛋白HP-1（heterochromatin protein 1），给有丝分裂提供动力的动力蛋白dynein，动力蛋白激活蛋白dynactin等，因此是与DNA的分配过程有密切关系的酶。2012年，美国圣迭哥州立大学（San Diego State University）Mark Sussman的实验室用BrdU标记DNA链的方法来检测心肌干细胞进行不对称分裂的状况，发现增加Pim-1的量能够使不对称分裂的几率加倍，说明Pim-1在干细胞保留永生DNA链的过程中起重要作用。

组蛋白H3上缬氨酸的磷酸化

      2015年，前面提到过的美国约翰·霍普金斯大学Xin Chen的实验室还表明，在雄性果蝇的生殖干细胞的分裂中，组蛋白H3上缬氨酸的磷酸化状态与细胞是否进行不对称分裂有直接关系。在H3第3位的缬氨酸被磷酸化时（H3T3ph），干细胞进行不对称分裂，带有H3T3ph修饰的组蛋白H3与辈分高的DNA在一起。如果把第3位的缬氨酸变为不能被磷酸化的丙氨酸（H3T3A），细胞就从不对称分裂变为对称分裂。这个结果被发表于《细胞》（Cell）杂志上，是组蛋白的修饰状况与干细胞分裂方式关系直接有关的证明。

Wnt 信号链

       2011年，加拿大多伦多大学（University of Toronto）Cindi Morshead 的实验室报道说，在进行不对称分裂的小鼠神经干细胞中，Wnt信号传递链的活性被抑制，而在进行对称分裂的神经干细胞中，Wnt信号传递链活跃。Wnt是果蝇的翅膀缺失基因wg（wingless）和小鼠致癌基因intl（integration 1）两个名称的混合，因为在不同动物中发现的这两个基因实际上是同一个基因，从线虫、果蝇、小鼠和人中都高度保守，在动物胚胎发育和器官形成上起在重要作用。在成体动物中，Wnt信号看来是和保持干细胞增殖的特性（即通过对称分裂增加干细胞的数量）有关，而在干细胞进行不对称分裂时，Wnt信号链必须被关掉。

左-右不对称蛋白Lrd

  最有趣的恐怕要数干细胞的不对称分裂居然与决定小鼠内脏左-右不对称的蛋白Lrd（left-right dynein）有关。敲除小鼠的lrd基因，小鼠内脏位置左右不对称（类似人的心脏在左边，肝脏在右边）的情形就被打乱，变成随机的。前面谈到的美国国立癌症研究所的Amar Klar发现，降低小鼠胚胎干细胞中lrd信使RNA （mRNA）的浓度，干细胞就不再进行不对称分裂，也不再保留永生的DNA。

  目前得到的这些研究结果还是零星的，彼此之间也没有关系。这就像一张复杂的拼图，我们手里只有少数几片，还彼此不相连，然而这些结果已经展示出，干细胞的不对称分裂和保留永生DNA链的过程是非常复杂的，要弄清它还需要大量的研究工作，但是目前对机制还认识不足的状况并不影响我们了解永生的DNA链存在的事实。

  永生的DNA链，其实还和永生的生殖细胞一脉相承。

永生的DNA链和永生的生殖细胞

  其实在干细胞中“永生”的DNA链出现之前，所有的生物就已经发展出永生的生殖细胞了。生物的物种要延续，必须要有把生命传给后代的生殖细胞，而且由生殖细胞繁殖出来的后代的寿命不会由于繁殖代数的增加而减少，否则物种就会凋亡。现在我们身上的每一个细胞，都是几十亿年前那个单细胞祖宗连续不断分裂的后代。从这个意义上讲，生殖细胞真的是永生的。

  与此相反，组成生物身体的细胞，即体细胞，都是有寿命的。无论体细胞有多少防御和修复机制，都终将死亡。由体细胞组成的生物体也都有寿命，而且许多体细胞的寿命比生物体总的寿命要短。

  但是生殖细胞和体细胞含有完全的DNA，生殖细胞所含有的基因，体细胞都具有，为什么体细胞就必然死亡，而生殖细胞却能够永生？答案看来就在于生殖细胞具有和体细胞不同的外遗传修饰。要更详细地了解这个问题，可以参看作者的另一篇文章《为什么生殖细胞能够永生？》，发表于2014年5月10日《科学网》的博客，或者《生物学通报》2014年第5期中的文章。

  干细胞是随着多细胞生物的出现而发展出来的，它们在身体发育完成后，执行替补体细胞的任务，完成这个任务的过程和由生殖细胞发展出体细胞相似，因此可以看成是生殖细胞在身体各个组织中的延伸，或者“派出部队”。干细胞和生殖细胞都是分化程度很低的细胞，都有保持自己“真身”的任务，而且都是通过外遗传修饰来完成的。

  干细胞数量不多，要在替补体细胞的同时保留自己，就要进行不对称分裂，其中的一个“子”细胞要继承自己干细胞的身份和任务。因此在干细胞细胞分裂时，作为干细胞后代的“子”细胞不仅要继承干细胞的DNA，还必须继承维持干细胞特性的外遗传修饰，而这些外遗传修饰是和干细胞中年龄较大的DNA联系在一起的，看来这就是干细胞分裂时要选择性地保留“爷爷”辈DNA的主要原因。干细胞在保留原有外遗传修饰的同时，也就保留了与这些外遗传修饰相连的，DNA链的“原件”，这样既能够保持干细胞的“真身”，又能够大幅减少DNA链通过复制过程导致的序列变化，降低癌细胞发生的可能性。写到这里，我们不得不佩服生物的“聪明”，生物演化的创造力也远超出我们的想象。

  不过把干细胞所保留的DNA链说成是“永生”的，则只有相对的意义。干细胞毕竟不是生殖细胞，而是会随着生物体的死亡而死亡的，里面的DNA链也就不可能“永生”。干细胞除了进行不对称分裂，还会进行对称分裂，对称分裂时DNA复制造成的错误也会保留在后代的干细胞中。如果含有“原始文件”的干细胞由于某种原因死亡，而继承带有复制错误的DNA链的干细胞后代存活下来，也可以导致“原始文件”的毁灭。出于这些原因，在这篇文章中，我们给永生二字加上了引号。但是如果我们考虑到Cairns当初提出“永生DNA链”的概念时，他的目光只限于干细胞，而且没有考虑到干细胞还进行对称分裂的情形，他把干细胞保留的DNA链称为是“永生”的做法就是可以理解的。因为在干细胞寿命的范围内，被干细胞保留的DNA链还真的可以是“永生”的。

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