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利用agoTRIBE检测单细胞转录组内miRNA靶标

已有 890 次阅读 2023-11-15 22:07 |个人分类:科普|系统分类:科普集锦

利用agoTRIBE检测单细胞转录组内miRNA靶标

miRNA是小的非编码RNA，其转录后调节蛋白质编码基因的表达。从机制上讲，它们引导Argonaute效应蛋白到达信使RNA靶点，允许Argonaute和辅助因子抑制mRNA的翻译和/或促进降解。miRNA几乎存在于所有多细胞动物和植物中，并在许多生物过程中发挥重要作用，包括发育、细胞身份的形成和人类疾病，如癌症。人类基因组中有数百个不同的miRNA基因，每个miRNA基因都可以调节数百个目标基因。每个单独的miRNA的功能是由其特定的靶标库定义的，因此，为了了解给定miRNA的功能，有必要绘制其靶标。目前最先进的方法是交联免疫沉淀测序(CLIP-seq)，该方法使用紫外线将Argonaute蛋白与其细胞中的mRNA靶标交联，然后使用抗体分离蛋白质，并使用下一代测序来分析结合的RNA靶标。该方法为miRNA领域带来了许多新的见解，但也存在一些固有的局限性。首先，由于抗体的分离效率低下，它需要数以百万计的细胞作为输入，这使得它不适合材料有限的样本——更不用说单细胞了。通过平均数百万个细胞，CLIP-seq掩盖了潜在的细胞间变异。其次，该方法是费力的，需要许多专门的协议步骤，包括紫外线交联和免疫沉淀。

最近，Sekar等人提出了一种新方法agoTRIBE（图1），它绕过了这些限制。他们表明，agoTRIBE产生的结果与更费力的CLIP-seq方法是一致的。报道的miRNA靶点受到进化序列守恒的支持，并受到功能性miRNA抑制。此外，作者们发现agoTRIBE可以用于检测人类单细胞中miRNA -靶标相互作用，以及在细胞周期的不同阶段对miRNA靶向进行反卷积，而无需进行物理细胞分选。

图1 agoTRIBE融合了AGO2和ADAR2的编辑域。a、 agoTRIBE方法的示意图。agoTRIBE方法将人类Argonaute2与人类ADAR2的腺苷脱氨酶结构域融合，携带一个过度活跃的突变(E488Q)，并在目标转录本上进行编辑。编辑后的核苷酸可以通过标准或单细胞RNA-seq检测到A>G取代。上图:人类Argonaute2的n端标记示意图。b、利用AlphaFold2预测人类Argonaute2蛋白结构。标记嵌入在蛋白质结构中的C端可能导致错误折叠的蛋白质无法装载miRNA。c，免疫荧光染色显示agoTRIBE。采用AGO2(绿色)和ADAR2(红色)免疫荧光染色(co-IF)检测agoTRIBE，采用DAPI(品红色)进行核染色。每个显微镜实验至少在两个重复中进行，并显示一个有代表性的实验。胞质病灶的共定位表明，agoTRIBE存在于p体中

agoTRIBE相关代码参见https://github.com/vaishnoviS/agoTRIBE。

参考文献

[1] Sekar V, Mármol-Sánchez E, Kalogeropoulos P, Stanicek L, Sagredo EA, Widmark A, Doukoumopoulos E, Bonath F, Biryukova I, Friedländer MR. Detection of transcriptome-wide microRNA-target interactions in single cells with agoTRIBE. Nat Biotechnol. 2023 Sep 21. doi: 10.1038/s41587-023-01951-0.

以往推荐如下：

1. 分子生物标志物数据库MarkerDB

2. 细胞标志物数据库CellMarker 2.0

3. 细胞发育轨迹数据库CellTracer

4. 人类细胞互作数据库：CITEdb

5. EMT标记物数据库：EMTome

6. EMT基因数据库：dbEMT

7. EMT基因调控数据库：EMTRegulome

8. RNA与疾病关系数据库：RNADisease v4.0

9. RNA修饰关联的读出、擦除、写入蛋白靶标数据库：RM2Target

10. 非编码RNA与免疫关系数据库：RNA2Immune

11. 值得关注的宝藏数据库：CNCB-NGDC