circRNA对microRNA的调控 

尽管几十年前就发现了植物类病毒，但环状RNA (circRNA)的重要性直到2012年才被发现，当时对RNA测序的计算分析揭示了各种组织和细胞中的数百种环状RNA。环状RNA被归类为广泛表达的新型单链RNA，因为它们的闭环结构缺少3‘和5’末端。尽管大多数环状RNA是通过反剪接从蛋白质编码mRNA的外显子上剪接出来的，内含子、基因间区或反义区也可以产生环状RNA。已经阐明了多种途径来了解环状RNA的生物发生过程。线性剪接模型通过内含子配对进行，内含子配对使剪接信号靠近外显子，然后进行反向剪接。直接反剪接也可以在RNA结合蛋白(RBP)的帮助下进行。生物发生的另一种机制涉及外显子跳跃促进的含外显子分支的形成和循环。环状RNA具有独特的环状结构和后剪接连接，并且在相关物种中被观察到是保守的。由于其共价闭环结构，与其他类型的RNA相比，circRNA的半衰期更长，这为其作为治疗靶点和诊断标记物提供了巨大的潜力。 

已经确定，circRNA通过充当miRNA海绵、与RBP关联并产生蛋白质来介导基因调控。CDR1as (ciRS-7)是第一个报道的内源性circRNA，具有超过70个结合位点，作为miR-7的海绵，并进一步调节下游基因。此外，Hansen及其合著者还发现环状RNA Sry可作为miR-138海绵。这些初步研究之后，大量报道表明circRNA-miRNA-mRNA调控网络是基因调控的重要参与者之一。随着circRNA-ceRNA网络在当前研究中的普遍作用，非编码RNA对miRNA的海绵作用也受到了质疑。值得注意的是，只有少数环状RNA的miRNA结合位点密度高于偶然预期。根据“目标阈值效应”假说，mRNA、miRNA和circRNA应具有相似的表达水平以实现最佳调控。由于ceRNA网络中单个RNA的表达水平和拷贝数对于靶基因的最佳调控至关重要，因此考虑miRNA与circRNA和靶基因mRNA的实际水平的比较变得至关重要。然而，术语“海绵”有时可能会误导，有必要深入了解这种基因调控机制。最近综述文章《Regulation of microRNA by circular RNA》[1]批判性地讨论了circRNA-miRNA相互作用的可能影响，并提出了不同的方法来验证circRNA-miRNA调节轴的功能。 

在过去的十年中，人们揭示了circRNA的关键细胞功能，包括转录调控、作为miRNA的内源性竞争对手、作为RBP的支架，以及最近发现它们被翻译成环状蛋白。尽管circRNA通过多种机制调节基因表达，但circRNA海绵作用miRNA的初步突破性发现推动了该领域朝着支持circRNA-miRNA调控轴的方向发展。 在这里，作者们首先讨论了circRNA通过与miRNA结合来调节基因表达的可能机制（图1）。 

图1 功能circRNA-miRNA-mRNA调控网络示意图。miRNA过表达(左上)通过与靶mRNA的3’UTR内的MREs结合抑制靶基因表达。相反，带MREs的circRNA过表达可以作为ceRNA隔离大部分导致靶基因表达降低的靶miRNA(右上)。同样，circRNA的低表达(左下)导致miRNA抑制基因表达的生物利用度增加，而miRNA的低表达(右下)促进基因表达。 

在高通量测序技术和复杂的分析管道的帮助下，已经发现了许多环状RNA。大多数关于circRNA的研究表明，它们的功能作用是通过与miRNA和RBP的物理关联来实现的。因此，由各自的circRNA调控的miRNA的选择标准以及它们相互作用的表征对于定义circRNA-miRNA-mRNA轴至关重要。在这里，作者们描述了几种验证circRNA与miRNA相互作用的策略，基于这些策略可以选择miRNA/circRNA靶点以进一步验证其生物学功能(图2)。 

图2 不同circRNA-miRNA相互作用分析方法的示意图。(a)使用ASO进行circRNA下拉，然后使用RT-qPCR和RNA-seq来鉴定circRNA相关的miRNA。(b)克隆荧光素酶基因下游MRE序列或突变MRE的circRNA，分析目标miRNA的抑制作用。(c)标记microRNA下拉实验，通过标记microRNA下拉目标circRNA，并通过RT-qPCR或RNA-seq检测。(d) circRNA-miRNA相互作用实验分析circRNA-miRNA相互作用，通过滚动圆环扩增circRNA来放大信号。(e) RNA-FISH对circRNA和miRNA的共定位分析揭示了circRNA - miRNA在体内的相互作用。(f) siRNA/ GapmeR沉默circRNAs或质粒载体过表达circRNA可改变靶miRNA的生物利用度，导致靶基因表达改变 

先进微阵列和高通量测序平台的发展导致了一大家族新型环状RNA的发现，这为进一步阐明已报道或即将报道的环状RNA作为诊断或治疗靶点提供了充足的空间。曾经被认为是错误剪接的产物，circRNA已经走了很长的路，通过与miRNA和RBP相互作用在各种关键的细胞过程中发挥作用。近年来，人们对circRNA-miRNA调控网络进行了广泛的研究，特别是在各种生理和疾病条件下，通过采用多种策略来研究环状RNA对miRNA的海绵作用。然而，与其他线性RNA相比，大多数circRNA的表达水平非常低，这反驳了circRNA对海绵miRNA的ceRNA功能。另一个反对circRNA的主要论点是，在研究中，研究人员认为circRNA在整个转录组中具有更高的miRNA结合位点密度，而大多数circRNA只有少数miRNA结合位点，仅占整个转录组中miRNA结合位点的一小部分。重要的是，circRNA的低丰度和大多数circRNA上仅存在少数miRNA结合位点表明，大多数circRNA可能不会在ceRNA网络中充当miRNA海绵。因此，仔细选择技术，确认circRNA与miRNA的物理相互作用，并对其功能意义进行批判性评估，可以避免在这一新研究领域得出误导性结论。 

未来关于circRNA-miRNA调控轴的研究可以考虑几个要点，以成功识别和验证circRNA-miRNA的功能性相互作用。首先，circRNA和靶miRNA的直接相互作用必须通过ASO下拉、cmRRI、RNA-FISH等检测来验证。尽管这些实验可能导致假阳性的circRNA-miRNA相互作用，但使用多种方法增加了鉴定circRNA-miRNA真正相互作用的机会。此外，转录组范围内的circRNA-miRNA相互作用位点仍有待探索。 

其次，ceRNA假说表明，在miRNA和ceRNA表达接近相等的情况下，能够达到基因表达的最佳调控。综合分析相关miRNA的实际拷贝数、circRNA中的MREs以及特定条件下的mRNA，可能有助于识别真正的miRNA海绵，这些miRNA海绵调节下游靶基因。cirFISH和ddPCR可用于评估circRNA、miRNA和mRNA在调控轴上的实际拷贝数。同样重要的是要认识到，在任何给定条件下表达的数百种具有相同MRE的其他转录本也是ceRNA串扰的一部分。 

第三，环状RNA作为海绵，可以将miRNA从其mRNA靶标中隔离出来，这意味着可以缓冲活性而不是降解。然而，circRNA作为其他miRNA/RBP的海绵对miRNA生物发生的调控还需要更深入的研究。由于最近的一项研究报道了miRNA被靶RNA降解，因此不能排除circRNA定向miRNA降解的可能性。必须进行全面和公正的研究，以发现通过相互作用环状RNA直接调节miRNA水平的可能性。 

第四，最近的几项研究建立了circRNA通过m6A或IRES转化为多肽。然而，circRNA翻译的程度和circRNA编码蛋白的表达水平需要进一步研究。最近的一项研究表明，eIF3j介导的circRNA翻译抑制对热休克的响应。此外，miRNA与翻译circRNA相互作用的作用仍有待了解。由于已知miRNA会影响帽依赖性翻译，因此需要进一步的实验来阐明circRNA相互作用的miRNA对circRNA翻译的可能调控。 

第五，必须通过RNA-seq分析circRNAs对全局转录组的调控，以确定通过miRNA的调控轴。此外，circRNA改变调控RBP/酶的定位可以调节miRNA的表达或生物利用度，从而调节靶基因的表达。尽管miRNA相关的环状RNA定位于细胞质中以调节miRNA的活性circRNA的不同亚细胞定位可能影响miRNA在神经元等特化细胞中的定位功能，其中许多翻译事件发生在远离细胞核的远轴突端。因此，在研究circRNA-miRNA调控轴时，可以考虑circRNA、miRNA及其下游mRNA的亚细胞定位。 

最后，除了抑制基因表达外，一些miRNA还在转录和转录后水平上调基因表达。 miRNA可能通过向启动子募集转录因子和RNA-Pol II来促进基因表达。miRNA介导的基因上调是一个新兴的研究领域，与circRNA-miRNA海绵结合，可以作为circRNA-miRNA-mRNA途径驱动的基因调控的一种未被探索的可能性。 

综上所述，近年来，通过circRNA作为ceRNA进行基因表达的激动人心的机制引起了人们的极大兴趣。尽管circRNA-miRNA轴提供了靶基因表达的分子机制，但ceRNA机制应该在整个转录组中所有MREs的背景下仔细研究。 尽管这篇文章强调了circRNA作为miRNA的ceRNA的潜力，但任何给定细胞类型中circRNA-miRNA-mRNA调控轴的全图还远未完成。更深入地研究circRNA-miRNA调控轴及其在治疗中的应用，将有助于改善人类健康。 

参考文献

[1] Singh, S., Sinha, T., & Panda, A. C. (2023). Regulation of microRNA by circular RNA. WIREs RNA, e1820. https://doi.org/10.1002/wrna.1820 

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