成药性评价基础篇——ADMET简介

前言

应领导的要求，需要起草一篇关于实际业务的基本介绍，便于同事熟悉这个平台，也便于客户了解目前ICE的成长与未来的布局。有些难度，尽力而为吧。

在进入正文之前，先介绍一些基本概念，以及加入公司后的一些感受：

ICE=Ion Channel Explorer=Innovative CRO⁺ Explorer，公司的Logo，蕴含了更为广阔的平台与可能，路还很长，如何满足创新对基本能力的需求，是我们一直努力的方向。

爱思益普=爱求索、思新异、益中国、普创新。新的含义，新的动力，新的目标。在这里，我深深感受到团队浓厚的学习氛围，无论新人还是老人，大家对知识的追求与渴望，是我之前所不曾遇到的，这也体现了该行业对从业人员知识与智慧的新要求，毕竟有太多前瞻性的研究。

ADME=Absorption（吸收）, Distribution（分部）, Metabolism（代谢）和Excretion（排泄），有时也考虑Toxicity（毒性）和Liberation（释放），也被简写为LADME, ADMET或LADMET。在药物发现的同仁眼里，ADME主要是描述药物代谢动力学（pharmacokinetics， PK），在毒理学家眼里，ADME更像是描述毒代动力学（Toxicokinetics，TK），二者关注的浓度范围和测量的参数还是有区别的。

Processes in pharmacokinetics

爱思益普从实际出发，专注生物学领域，致力于加强自身创新研发能力，以临床需求为导向，跟随北京建设国际科技创新中心的脚步，希望加强基础科研探索创新的能力，致力于为中国创新事业而奋斗。我们还有很多工作要做，需要更多平台的合作，更多新工具的融合，更多新方法的验证。公司为行业提供合作服务平台，希望能融合创新，产生新动能，以适应行业高质量发展要求。

以此为导向，就容易理解我们下游的平台布局了，既有CRO服务的能力，也有方法开发的能力，支持创新性研究，有支持药物研发一体化平台的能力，也有支持早期靶点验证与探索的能力，核心能力是发现问题和解决问题的能力。

体外ADME和体内PK

简单来说，ADME，围绕解决的是药物在到达靶点之前发生了什么，发挥作用之后又发生了什么。将每一步细化、量化，有了共同的药物特性语言，便于药物化学家更好的优化化合物结构，而不是凭感觉，这就是以科学为导向，也是药物申报时所必须提供的数据支撑。ADME的领域是经历过多个药物研发项目论证及临床数据支持的。

展开讨论ADME之前，需要简单介绍下药物化学家的需要的数据。在小分子药物研发领域里，无疑药化专家的位置非常关键，他们需要了解的内容太多，比如CADD/AIDD、合成化学、生物化学、药理学、分子生物学、生理学、药代药动理论等等，需要在药物研发过程中绘制结构-活性关系（Structure-activity relationships, SAR）和结构-性质的关系（Structure-property relationships）。在SAR中，需要大量的结构信息、生物活性数据（酶学、细胞学）、ADME、hERG、PK/PD和体内药效、毒性等参数，来决定下一步的药物设计计划。当我们确定体外生物学活性之后，ADME的参数，就变的更为重要，希望在成药性方面继续优化化合物的结果，进而得到更合适的PK参数，以达到好的体内药效活性。

药物研发需要涉及的知识领域（ICE绘制）

一般来说，在体外的ADME平台中，经常需要评价如下参数，如溶解度，化学稳定性，渗透性，代谢稳定性，油水分配系数、血浆/组织结合率等，深入一步也需要测试CYP酶表型分析，CYP酶底物评价，CYP酶抑制，CYP酶诱导、全血分配，转运体底物评价，转运体抑制，代谢物鉴定等等方面。目前这些数据，俨然成为了人们必须关心的性质，但是早在上世纪80年代之前，药物研发的公司还主要是依据药物的活性来筛选化合物，后来发现很多临床上失败的项目。为了搞清楚其缘由，Prentis等人汇总分析了UK七家药物研发公司在1964-1985年间的项目，发现临床失败有40%是因为PK方面的缺陷。¹PK方面，主要是关注机体对药物所产生的一些作用，当时人们已有一些猜想，比如药物口服后在胃肠道（gastrointestinal tract，GI tract）吸收如何？如果不被吸收，那么药物自然也会没有作用。药物在全身的分部如何？还是集中在某些器官中，无法发挥作用，且容易引发毒性？对于靶向中枢神经系统（central nervous system，CNS）的药物，是否能通过血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）？药物在机体中的代谢如何？有哪些酶对化合物发生了作用？药物是否经过肾脏排泄还是经过肾小管再次吸收？由此其实已经看到了ADME的重要性。后来Richard K. Harrison团队也分析了2008-2015年间，临床试验失败的主要原因，大部分是由于有效性和安全性方面的问题。²为了让问题早点被发现、早点解决，体外的ADME数据和体内的PK数据对比分析，同时在临床前评价药物特异性和安全性的风险，已经成为了目前药物研发的主流。

再过去的数十年中，制药企业已经开发了很多通量的实验方法、自动化的平台、细胞实验材料、数据分析模型等等，被应用到体外ADME参数的评价上。为了更好的解释体外的数据，体内PK的研究也伴有快速的发展。理想状态下，需要知道体内的药物随着时间的变化，了解药物在机体内的吸收、分部、代谢和排泄等方式，实际上需要选取可操作方法。人们引入了一些关键的药代动力学参数，如清除率clearance (CL), 表观分布容积volume of distribution (Vd), 半衰期half-life (t1/2)和生物利用度bioavailability (%F)。这些参数已知的情况下，一般能初步预测化合物是否能在特定的靶点位置发挥作用。当然，还有更为细致的方法去确认化合物在体内的作用，需要进一步结合体内药效、组织分布中的药物浓度与可能发挥作用时间等等。

2  Clearance (CL): Volume of blood cleared per unit time

2  Volume of distribution: Compares drug plasma concentration to total drug in the body

2  Half-life (t1/2): Time to decrease drug concentration 50%.

2  Bioavailability (%F): Percentage of dose reaching systemic circulation

In vivo PK parameters³

爱思益普设置DMPK部门，主要涵盖体外ADMET、体内PK和PD的部门，就是为了更好的配合分析药物ADME与PK的性质，结合体外生物学和体内药效学，可以更好的为合作伙伴展示较为全面的数据，及时给药化团队反馈关键信息。因为我们的工作不仅仅是完成指定的测试，更希望我们的配合与联动，能更好地、更快的支持到中国的药物研发项目，加速中国创新药物研发进程。

吸收（Absorption）

药物的吸收是制药企业在口服药物研发项目中非常关注的参数，通常保证给药时间不要低于每天一次，这样患者用药更为便捷。影响吸收的主要参数是溶解度（solubility）和透膜性（permeability）。之前不太关注生理学，现在想一想，药从口入，如何达到靶向位置？如何保持其疗效？这里需要用到太多的基础理论和评价方法。药物的旅行，需要经过一道又一道的防线和屏障。自药物服入口中那一刻起，余下的路，就要靠它自身的防护与特性，随着机体的自然循环，到达靶向位置，并与特定的靶点结合，完成使命，之后还需要排出体外，减少因积累而引起的毒性。这是一场机体与自我分子的对抗。

本质上讲，一个化合物容易溶解，需要让溶剂分子更好的与分子结合。对于药物来说，需要水分子能更好的与药物自身结合，这里就有一些点需要考虑，如分子量、极性、氢键供体和受体、氨基的引入等。一般来说，水溶性与亲脂性成反相关。亲脂性可评价化合物在互不相溶的非极性液体和极性液体的两项分配测得，常由Log D和Log P来表征。亲脂性也与ADMET的其他参数有关，比如渗透、分布、血浆蛋白结合、代谢、消除和毒性等，也有报道称和药动学分布容积V_d有关。

在评价溶解度时，经常会有一个疑问：化合物的溶解度是多少才合适？这个问题不能单纯的分析溶解度，还需要结合其他ADME参数，还有化合物的体外生物测试活性，同时人们也会关注化合物溶解的速率，这个与化合物的晶型有关，也会在实际中测得动力学溶解度（Kinetic solubility）和热力学溶解度（Thermodynamic solubility）。对于药物化学家而言，通常可将溶解度分为3个档次：

2  Low solubility: <10 μg/mL

2  Moderate solubility: 10–60 μg/mL

2  High solubility: >60 μg/mL

Comparison of the distribution of drug solubility on the US, GB, ES, JP, and WHO lists.⁴

渗透（Permeability）

对于一个口服的药物研发而言，当一个化合物溶解度能接受的情况时，渗透性也需要得到改善。毕竟化合物经肠胃道（GI tract）吸收，还要经过一些屏障才能进入体循环（Systemic circulation）。一个高活性、溶解度高的化合物，如果渗透性不好，吸收也会大大下降，也不具备成药性。即使进入体循环，需要到达靶器官、靶细胞、靶点等，还需要经过很多膜结果，这些都要求分子有一定的渗透性。

化合物透过膜的方式有很多种，如下图所示，一般包括：

2  A，被动扩散Passive diffusion

2  B，主动转运 Active transport

2  C，内吞 Endocytosis

2  D，外排Efflux

2  E，旁路转运 Paracellular transport

对于大部分药物而言，选择的是被动扩散的方式，上市的药小分子物中约有95%的药物经过此种方式被吸收。在这里，分子的极性就比较关键，一方面需要溶于水溶液中，一方面还需要透过极性较差的磷脂双分子层的膜结构；同时胃肠道中的pH值对药物的溶解度和渗透性也有很大的影响。如何优化亲脂性和极性，成为了优化渗透性的关键环节。也可以通过调节分子拓扑极表面积（topological polar surface area，TPSA)来调整分子的渗透性，也可以减少分子内部的旋转键（rotatable bonds），增加分子的刚性（Rigidity）来提高渗透性。实际中也常常用到Caco-2、MDCKII-MDR1，CHO-BCRP、PAMPA等模型来评价分子的渗透性。

分布（Distribution）

无论是口服、静脉注射或者其他方式，当药物进入体循环时，就可能进入肌肉和其他器官来减少血液中的化合物浓度。通常药物在机体内的分部并非均匀，一些药物很容易进入其他组织，而一些药物却继续停留在血液循环系统中。药物需要达到靶点的位置才会发挥药效，一些因素也会影响到该过程，比如局域血流速度、分子大小、极性、血浆蛋白结合率等，需要进入脑部的药物还需要经过致密的血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）。停留到不合适的组织，也会引起脱靶效应导致的毒副作用。由此，人们会关注药物进入血液循环后的去向，也就是分布。

分布主要和分子的几个特性有关，如渗透性、转运体的影响，以及血浆蛋白结合率。和胃肠道渗透性有关的一些特征，往往也会影响化合物的分布特性如亲脂性、极性、TPSA、分子的刚性等。被动扩散在胃肠道吸收时占主要作用，而转运体对化合物的分布的影响较大。不同组织、细胞上的转运体表达种类、含量等等，都会影响化合物的分布。通常来讲，转运体会表达在膜的一侧，或者顶层，或者底层。通常转运体对化合物的转运需要ATP/ADP水解提供能量，转运体的转运能力也会被高浓度的化合物饱和，这也是转运体在吸收的过程中影响不明显的一个原因。主要研究的一些转运体见下表所列。对于外排功能的转运体，一般会优先研究P-gp和BCRP。有时化合物可以是不同转运体的底物。

Transporters Affecting Gastrointestinal Absorption of Some Drugs⁵

血浆蛋白结合（Plasma protein binding，PPB）对分布的影响也较明显，进入血液中的分子，通常会与血液中各种组份结合，如红细胞、血小板、白细胞、血浆蛋白等，这些结合都会影响化合物的分布。而PPB是人们关注较多的一个指标。常见的血浆蛋白有人血清白蛋白（human serum albumin，HSA)和酸性糖蛋白（α1-Acid Glycoprotein，AGP)，他们通常也与外源毒性分子结合。HAS占比较多，占比高达60%的血浆蛋白，通常在35~50 mg/mL (500~750 μM)，相比而言，AGP占比在1~3%。通常AGP会通过疏水性非特异结合疏水性和碱性高的分子，有一个结合位点。而HSA的结合位点较多，且可以结合酸性、碱性、中性的大多数分子。

PPB的重要性和一些基本原理可参考Smith的综述⁶，主要提出游离化合物猜想（Free drug hypothesis），认为PPB结合的化合物不能通过被动扩散或细胞间转运通过膜结构，只有游离的化合物才可以通过生物膜结构，运出血液循环系统，达到目的器官、细胞和靶点。对于PPB结合能力较强、且解离速度较慢的化合物，则容易滞留在血液循环系统中，将影响到化合物在组织中的分布。

消除（Elimination pathways）

药物发挥作用后，如何消除也是关键的一环。主要有两种方式消除，一种是经过酶的修饰，改变母药结构，经代谢通路消除；另一种是不改变化合物的结构，经过肾脏的尿道消除。通过计算消除的路径及速率，可以很好的了解到药物在机体内停留的时长。想到这里，往往会觉得人类的身体确实很高级、很神奇。

代谢（Metabolism）

当化合物通过胃肠道吸收后，就会进入门静脉，被运送到肝脏，之后进入全身体循环。化合物的代谢可以发生在很多过程中，但最为主要的是发生在肝部。化合物希望进入体循环，必须首先经过肝清除的过程，这也被称为首过效应（first pass effect）或首过代谢（first pass metabolism）。每次经过一轮体循环，化合物都会经过肝脏一次，代谢的过程也会发生多次，每次都会减少化合物的余量，由此可见肝部代谢对化合物的生物利用度影响较大，代谢也是药物研发项目中被高度重视的步骤。

First pass and plasma drug levels （from website）

化合物代谢可被分为两步，I相代谢和II相代谢。一般来说，I相代谢主要是通过氧化、还原、水解、脱烷基的方式改变分子的极性，就好比增加一个把手，利于后续的肾脏清除。这里关键的是单氧酶（monooxygenase），如细胞色素P450（cytochrome P450，CYP)和黄素单氧酶（flavine monooxygenase，FMO)家族成员。II相代谢主要是在分子中增加极性基团，通常会利用I相代谢增添的修饰，也会利用自己的酶系统催化底物的修饰，如葡萄糖醛酸（glucuronic acid）、谷胱甘肽（glutathione），通常也是结合反应（conjugation reactions）。葡萄糖醛能够与芳香族和脂肪族羟基结合，羧酸和胺可以通过UDP葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferases，UGTs），行程葡萄糖苷酸结合物，硫酸可以通过硫酸转移酶（sulfotransferases）与芳香羟基、脂肪羟基、羟胺羟基行程硫酸脂代化合物。II相修饰的化合物亲水性极大提升，增加了胆汁和尿的消除的可能性。

Phase I/II Drug Metabolism（from BD slides，December 2011）

 Typical phase 1 and 2 metabolic processes³

 I相代谢中的单加氧酶根据辅酶因子的不同分为不同类，其中有90%的药物会被CYP450修饰，这也是人们希望设计的分子对CYP450要有一定耐受的原因。Lewis团队在2004年的综述中提到了57个被发现的CYP450蛋白⁷，也被分为了18个家族。这类酶在药物研发中非常重要，也有很多相关的书籍详细介绍了其中原理和案例。本文只关注实际应用时比较重要的几个成员，按照重要性排序可以是CYP3A4, CYP2C9, CYP2D6, CYP2C19, CYP1A2, CYP2C8, CYP2B6等。爱思益普已经对应开发了通量酶学实验、LC-MS/MS实验，包括单点、IC50和TDI等测试。

CYPs的表达水平收到核受体的调控，比如AhR，CAR，PXR等蛋白，对应的会调节CYP1A2，CYP2B6和CYP3A4的表达量。核受体活化入核后会结合CYPs基因上有的启动子元件， 进而激活CYPs基因的转录和后续的翻译。由此人们也经常使用如下几种方法评价CYP的诱导，进而来指示DDI的风险：

2  酶活性水平，可以使用重组蛋白的方式直接LC-MS/MS测得酶的活性，观察化合物对酶活性的调节；

2  蛋白表达水平，可以使用原代肝细胞的方法评价细胞中对应CYP酶的活性，也可以通过WB的方法直接测量CYP酶在细胞中的表达水平；

2  mRNA水平，可以通过qPCR的方法定量原代肝细胞中不同CYP基因的含量；

2  转录水平，可以通过报告基因系统，评价AhR，CAR，PXR的活性。也可以通过其他的promoter评价核受体的活性，也可以通过免疫荧光的办法观察核受体入核的过程⁸。

排泄（Excretion）

化合物的清除速率，通常也受到排泄速率的影响，代谢生成的副产物，也经常通过排泄的通路被清除。一般来说，未带电荷的分子及其代谢物，可以通过尿、汗液、胆汁、乳汁，甚至呼吸等方式排泄出体外，其中主要的两种方式是肾脏的尿道排泄和肝脏的胆汁排泄，也通常被称作肾清除（Renal Clearance，Cl_R）和肝清除（Hepatic Clearance，Cl_H）。

肾脏的具体功能可以百度看一看，结合药物的排泄，可以亲切的体会到基础科学对药物研发的重要性。上学的时候未曾仔细研究，因为当时没有需求。当我们有开发出好药的需求的时候，我想大家再听课，会是不同的感受。肾脏中做可溶性分子交换的工作单元是肾单元（Nephron），它连接着血管和肾小管（renal tubule）。血液中的分子由肾动脉（Renal artery）进入肾小球（Glomerulus），这里的血管交织复杂，被肾小球囊（Bowman’s capsule）包裹，延伸出来的肾小管连接亨利式套（Loop of Henle）。肾小球中的血管孔径大小不一，利于小型分子的交换，这里与血浆蛋白结合紧密的分子，不易于通过此种方式排泄。会经过血管再次会到静脉，经历再一次的体循环。在肾小管的结构上，有很多外派转运体，可以经主动运输的方式将分子泵出体外，经肾脏排泄，比如一些弱酸、弱碱的化合物。

肝脏的排泄看似会简单些，主要溶在胆汁液体中，储存在胆囊，后分泌、经肠道被排泄。胆汁由肝细胞分泌的分泌液，在非消化期，胆汁经肝管转入胆囊内贮存；在消化期，胆汁可直接由肝脏和胆囊大量排到十二指肠，促进脂肪的消化分解和脂溶性维生素的吸收，主要包含水分、多种电解质、胆固醇、磷脂质、胆酸等组份。正常人每天分泌400-800mL的胆汁。

通过以上分析，便不再难理解成药性好药物其实需要一些基本的特性，这里就有人们常提到的Lipinski规则⁹，希望得到更好的吸收和渗透的特性，需要考虑如下几点：

2  分子量 <500

2  LogP<5

2  少于5个氢键供体

2  少于10个氢键受体

2  极性表面积(Polar surface area，PSA) <140 Ų

当然，还有其他的参考规则如Veber Rules¹⁰，Pardridge等人提出的BBB渗透模型，Oprea等人提出的“rule of 3”模型，还有对于分子量较大的“beyond rule of 5”模型等等。随着AI和PROTAC等领域的兴起，药物的评价和预测模式有了很大进展，未来可期。

后记

深入了解体外的ADME的数据，还需要与体内的PK（In vivo Pharmacokinetics）结合分析，一些参数如表观分布容积volume of distribution (Vd)，清除率clearance (CL)，半衰期half-life (t1/2)，生物利用度bioavailability (%F)将在下一期再做介绍，另外毒性的评价分析（ADMET中的Toxicity）也会单独放到下次文章做详细介绍。大分子和小分子的ADME还有很多区别，可参考Hong的综述¹¹，篇幅有限，可以后续再谈。

The ADME concept analogy between SMs (Small molecules) and LMs (Large molecules)

fa= fraction absorbed;

fg= fraction‐escaped gut first‐pass elimination;

fh = fraction‐escaped hepatic first‐pass elimination;

fS = fraction‐escaped degradation/catabolism at the injection site;

fL = fraction‐escaped degradation/catabolism in the lymphatic system.

爱思益普具有经验丰富的DMPK团队，建立了新药研发中临床前期的体内PK及体外ADME相关实验，体内PK实验包括啮齿类的大小鼠PK实验非啮齿类比格犬的PK实验、急性毒性实验、毒代实验等，支持多种溶媒的使用、多种给药方式给药、多种组织取材等。体外ADME实验包括药物溶解度实验、Log D、Log P值实验、肝微粒体和肝细胞代谢、抑制和诱导实验、PPB血浆蛋白结合（HTD和超离）实验、Caco2/PAMPA实验、Transporter等实验。ICE可以提供定制化的体内体外相关实验，更好的为客户提供药代动力学服务，助力新药研发。

A proposed translational PK–PD roadmap for protein degrader therapeutics¹²

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Reference

1          Prentis, R. A., Lis, Y. & Walker, S. R. Pharmaceutical innovation by the seven UK-owned pharmaceutical companies (1964-1985). Br J Clin Pharmacol 25, 387-396, doi:10.1111/j.1365-2125.1988.tb03318.x (1988).

2          Harrison, R. K. Phase II and phase III failures: 2013-2015. Nat Rev Drug Discov 15, 817-818, doi:10.1038/nrd.2016.184 (2016).

3          Blass, B. E. Basic principles of drug discovery and  development. 2nd edn,  (Elsevier, 2021).

4          Takagi, T. et al. A provisional biopharmaceutical classification of the top 200 oral drug products in the United States, Great Britain, Spain, and Japan. Mol Pharm 3, 631-643, doi:10.1021/mp0600182 (2006).

5          Kerns, E. H. & Di, L. Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to Toxicity Optimization.  (Elsevier Inc., 2008).

6          Smith, D. A., Di, L. & Kerns, E. H. The effect of plasma protein binding on in vivo efficacy: misconceptions in drug discovery. Nat Rev Drug Discov 9, 929-939, doi:10.1038/nrd3287 (2010).

7          Lewis, D. F. 57 varieties: the human cytochromes P450. Pharmacogenomics 5, 305-318, doi:10.1517/phgs.5.3.305.29827 (2004).

8          Smith, S. H., Jayawickreme, C., Moore, J. T. & Cote-Sierra, J. Tapinarof Is a Natural AhR Agonist that Resolves Skin Inflammation in Mice and Humans. Journal of Investigative Dermatology 137, 2110-2119, doi:10.1016/j.jid.2017.05.004 (2017).

9          Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W. & Feeney, P. J. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev 46, 3-26, doi:10.1016/s0169-409x(00)00129-0 (2001).

10        DF, V. et al. Molecular properties that influence the oral bioavailability of drug candidates. J Med Chem 45(12):2615-23, doi:10.1021/jm020017n. (2002).

11        Wan, H. An Overall Comparison of Small Molecules and Large Biologics in ADME Testing. ADMET & DMPK 4, 1-22, doi:10.5599/admet.4.1.276 (2016).

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