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环境微生物的培养基 精选

已有 20423 次阅读 2017-11-6 10:52 |个人分类:自然之旅|系统分类:科研笔记

1. 培养基的概念

培养基是根据科研或生产的需要,人工配制的、适合于不同环境微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质(混合养料)




培养基的作用:

促使环境微生物生长。

积累代谢产物。

分离环境微生物菌种。

鉴定环境微生物种类。

环境微生物细胞计数。

菌种保藏。

制备环境微生物制品。



培养基的特点:

任何培养基均应具备环境微生物所需要的六大营养要素,且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌(常规高压蒸汽灭菌:1.05 kg/cm2,121.3 15-30 min)



2. 培养基配制的原则

(1)培养基组分满足环境微生物的需要(目的明确)

不同种类的环境微生物对所需要的营养要求不同。针对不同的培养对象及目的,选取或设计不同营养特点的培养基。



(2)营养物的浓度与比例应恰当(营养协调)

从环境微生物的细胞结构物质分析,环境微生物所需要的营养要素之间的关系是:水>碳源+能源>氮源>P/SK/Mg>生长因子。

培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响环境微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。



营养物的浓度与比例应恰当,浓度过高时环境微生物的生长起抑制作用,浓度过小时不能满足环境微生物生长的需要。

其中碳氮比(C/N)直接影响环境微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累。

如细菌和酵母菌培养基所需要的C/N5/1,霉菌培养基中的C/N约为10/1

再如在谷氨酸生产中,C/N 4/1时,菌体大量繁殖,但谷氨酸积累少。C/N 3/1时,菌体生长受抑制,而谷氨酸大量增加。


(3)物理化学条件适宜(条件适宜)。如pH值、氧气、渗透压、氧化还原电位等均要符合微生物的生长需求。



pH

每种环境微生物生长都有自己的最适pH值范围。培养基的pH值必须控制在一定的范围内,以满足不同类型的环境微生物生长繁殖和产生代谢产物。



环境微生物在生长过程中培养基pH值可能发生的变化:

在含糖基质上生长,会产酸而使pH下降。

在分解蛋白质和氨基酸时,会产NH3而使pH上升。

(NH4)2SO4N源会过剩SO42-,而使pH下降。

分解利用阳离子化合物,如NaNO3,会过剩Na+而使pH上升。


为了维持培养基pH值的相对恒定,通常采用下列两种方式:

内源调节:在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐;调节培养基的碳氮比。

外源调节:按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液。

常用缓冲剂:K2HPO4KH2PO4组成的混合溶液、CaCO3CaHCO3、柠檬酸盐、乳酸盐等。



氧气及氧化还原电位:

根据环境微生物对氧气的要求不同,可以分为好氧型微生物和厌氧型微生物。

培养好氧型微生物:在实验室小样培养的器皿通常不是密封的,完全可从空气中获得氧气生长;在大型的发酵罐中,可通过无菌风和搅拌原料使微生物获得充分的溶解氧。

培养厌氧型微生物:除严格除去微生物培养环境中的氧气外,还需在培养基中加入还原态的化合物,降低氧化还原电位,减少氧气对其生长繁殖的影响。



不同环境微生物的氧化还原电位:

好氧微生物:较高0.3-0.4 V

兼性厌氧微生物:0.1 V

厌氧微生物:0.1 V以下,培养时要注意调节(驱走空气中的氧气,添加还原剂)



渗透压:

环境微生物的细胞膜是半透膜。当环境中的渗透压远低于细胞原生质的渗透压时,就会出现细胞的膨胀,轻者影响细胞的正常代谢,重者出现细胞破裂。当环境渗透压远高于原生质的渗透压时,导致细胞皱缩,细胞膜与细胞壁分开,即所谓质壁分离现象。所以,只有等渗条件最适宜微生物的生长。



水活度:

环境微生物可利用的自由水或游离水的含量用水活度来表示(Qw)。细菌水活度较高,约为0.8,酵母菌次之,耐旱的微生物水活度约为0.6

水活度值(Aw)是指在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比,即:AwPw/P0w

其中Pw代表溶液蒸气压力,P0w代表纯水蒸气压力。纯水Aw1.00,溶液中溶质越多,Aw越小。

环境微生物一般在Aw0.60-0.99的条件下生长,Aw过低时,环境微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。

细菌生长最适Aw较酵母菌和霉菌高,而嗜盐微生物生长最适Aw则较低。


(4)根据培养目的选择原料及其来源(经济节约)

应尽量利用廉价且易获得的原料作为培养基成分,特别是发酵工业,以降低成本,即“以粗代精”、“以野代家”、“以废代好”、“以简代繁”、“以烃代粮”、“以纤代糖”、“以氮代阮”、“以国产代进口”、“以无机氮代蛋白”。



一些重要、常用的培养基:

牛肉膏蛋白胨培养基和葡萄糖酵母汁培养基是常用的细菌培养基,它们能满足大多数异养细菌生长的营养需要。

含有淀粉和硝酸钾的高氏一号培养基是常用的放线菌分离培养基。

含有葡萄糖和蛋白胨的马丁培养基、天然的马铃薯或豆芽汁培养基是常用的真菌培养基。



3. 培养基的类型

(1)根据培养基成分划分:

天然培养基:采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的天然有机物。如牛肉膏蛋白胨培养基。

优点:营养丰富、种类多样、配制方便、价格低廉。

缺点:成分不清楚、不稳定。



合成培养基:用化学纯的营养料配制而成的培养基,因而确切地了解它所含的化学性质和含量,能满足许多种化能有机营养微生物的营养需要。如高氏一号培养基。

优点:成分精确、重演性高。

缺点:价格较贵、配制麻烦,且微生物生长比较慢。



合成培养基例子:

培养细菌:葡萄糖铵盐培养基。

培养放线菌:淀粉硝酸盐培养基。

培养真菌:蔗糖硝酸盐培养基。



半合成培养基:

由部分天然材料和部分已知的纯化学药品组成的培养基。如马铃薯蔗糖培养基、马铃薯肉汁培养基。

特点:配置方便、成本低、微生物生长良好。



(2)根据培养基外观的物理状态划分:

液体培养基:各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基。常用于大规模的工业生产中(如抗菌素、细菌肥料的生产)。不过用来培养好氧微生物,需解决通气问题。



固体培养基:液体培养基加一定凝固剂(如琼脂、明胶、硅酸胶、血清、鸡蛋、马铃薯等)便成为固体培养基。固体培养基主要用于菌种的分离、菌种保存、菌落特征观察及微生物种类鉴定等。



理想凝固剂所具备条件:

不被环境微生物分解、利用、液化。

不因消毒灭菌而被破坏。

在环境微生物的生长温度内保持固态。

凝固点的温度对环境微生物无害。

透明度好,粘着力强。



半固体培养基:

含少量琼脂的培养基(加入量为0.2-0.5%),称为半固体培养基,可用以观察细菌运动特征和鉴定菌种和测定噬菌体的效价等。



脱水培养基:

指含有除水以外的一切成分的商品培养基,使用时只需加入适量水分并加以灭菌即可,是一类既有精确成分又有使用方便等优点的现代化培养基。



(3)根据微生物培养目的划分:

种子培养基:适合微生物菌体生长的培养基。



发酵培养基:用于生产预定发酵产物的培养基。



繁殖和保藏培养基:用于菌种繁殖和保藏的培养基。


(4)根据培养基对微生物的用途划分:

选择性培养基:根据某一种或某一类环境微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。如固氮培养基、虎红培养基等。



用途:利用这种培养基可将所需要的环境微生物从混杂的微生物中分离出来。


加富性选择培养基:在普通培养基中加入某些特殊营养物质,如血清、血液、酵母膏、动物组织液等,用于培养对营养比较苛刻的异养环境微生物,如培养百日咳博德氏菌需要含有血液的培养基。



鉴别性培养基:在培养基中加有入与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂,从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。


伊红美兰乳糖培养基:伊红和美蓝两种苯胺染料可抑制G+和一些难培养的G-生长。伊红为酸性染料,美蓝为碱性染料,试样中的多种肠道细菌在伊红美蓝培养基上形成能相互区分的菌落:其中大肠杆菌能强烈发酵乳糖产生大量混合酸,菌体带H+,可与酸性染料伊红结合,美蓝再与伊红结合,使菌落在透射光下呈紫色,反射光下呈绿色金属光泽。产酸力弱的沙雷氏等属细菌菌落为棕色;不发酵乳糖不产酸的沙门氏等属细菌呈无色透明菌落。


(5)根据培养对象划分:

自然界中的环境微生物可分为细菌、放线菌、酵母菌、霉菌几大类,培养它们的培养基即分别称为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基、霉菌培养基。



常用的细菌培养基:营养肉汤、营养琼脂培养基。

常用的放线菌培养基:高氏1号培养基。

常用的酵母菌培养基:马铃薯蔗糖培养基、麦芽汁培养基。

常用的霉菌培养基:马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖(或蔗糖)、琼脂培养基、察氏培养基。



4. 培养基类型的选择

生态模拟:调查所培养菌的生态条件,查看“嗜好”,对“症”下料—初级天然培养基。



查阅文献:查阅、分析文献,调查前人的工作资料,借鉴人家的经验,以便从中得到启发设计有自己特色的培养基配方。



精心设计:借助优选法或正交试验设计法等方法。



实验比较:如不同培养基配方的选择比较、单种成分来源和数量的比较、几种成分浓度比例调配的比较、小型试验放大到大型生产条件的比较、pH和温度试验。


5. 培养基的配制

(1)培养基配制步骤



配置培养基时应注意的几个问题:

沉淀

胶体强度的破坏

褐色物质的形成

pH发生变化



(2)培养基的灭菌:

一般培养基:1.05 Kg/cm2121.3℃、15-30 min

含糖培养基:0.56 Kg/cm2112.6 ℃、15-30 min



影响灭菌的因素:

(a)培养基成分:培养基中脂肪、糖分和蛋白质含量越高,微生物的热死亡速率越慢。原因是在热死温度下,脂肪、糖分和蛋白质等有机物质在环境微生物细胞外面形成一层薄膜,可有效保护环境微生物细胞抵抗不良环境。因此,需较高的灭菌温度。



(b)培养基的物理状态:固体培养基的灭菌时间比液体培养基的灭菌时间长。原因是液体培养基灭菌时热传递有对流和传导,而固体培养基仅有传导。因此,对含有少量大颗粒及粗纤维的培养基灭菌,需提高灭菌温度,且在不影响培养基质量条件下,采用粗过滤方法预先处理,以防培养基结块而造成灭菌不彻底。



(c)培养基的pH:培养基的pH越低,灭菌所需时间越短。

(d)培养基的微生物数量:微生物数量越多,所需灭菌时间越长。

(e)微生物细胞含水量:含水量越多,蛋白质的凝固温度越低,容易受热凝固丧失生命活力。



(f)微生物细胞菌龄:年老细胞对不良环境的抵抗力强,年轻细胞易被杀死。


(g)微生物的耐热性:细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较敏感;放线菌、酵母、霉菌孢子比营养细胞的抗热性强;细菌芽孢的抗热性最强。




注:囿于个人水平有限,错误在所难免。敬请批评指正!此外,本博文图片和部分文字介绍均源于网络。特在此致谢!



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