在斯里兰卡上市的兽用狂犬病疫苗的效力

摘要

在斯里兰卡，有7种品牌的兽用狂犬病疫苗可以在市场上买到，但是没有既定的程序在地方一级测试疫苗的效力，尤其是在疫苗上市之前。本研究的目的是与位于法国ANSES南希的欧盟/WOAH/世卫组织狂犬病参考实验室合作，使用小鼠攻击试验来测试这些疫苗的效力。根据欧洲药典，如果最小处方剂量的估计效价≥1.0 IU，则灭活狂犬病疫苗符合小鼠效价试验。在8种受试疫苗中，四种单剂量制剂(Rabisin™、Raksharab™、Nobivac™ RL和Nobivac™ Rabies)符合标准，效价分别为12 IU/剂、7.2 IU/剂、4.4 IU/剂和3.4 IU/剂。三种单剂量制剂(Canvac™ R、Defensor™ 3和狂犬病灭活疫苗)不符合规定，效价值< 1.0 IU/剂。一种多剂量制剂(Raksharab™多剂量)的效价为1.3 IU/剂，尽管该试验未经验证。根据这些结果，目前在当地市场上销售的一些狂犬病疫苗批次似乎不符合小鼠效力试验。在注册和投放市场之前测试疫苗的效力似乎是在暴露前疫苗接种计划中对动物进行良好免疫接种的重要一步。

关键词:

抗狂犬病疫苗; NIH试验; 狂犬病; 斯里兰卡; 效力

1.介绍

狂犬病是一种被忽视的病毒性疾病，一旦患者患病，100%是致命的。除了疾病负担和每年报道的大量人类死亡之外，狂犬病还造成巨大的经济损失。这包括狂犬病流行国家超过1.3亿美元的犬疫苗接种费用和5.12亿美元的牲畜死亡，如非洲的阿尔及利亚、埃及、利比亚、斯里兰卡；南亚的巴基斯坦和印度；中亚的乌兹别克斯坦和格鲁吉亚；东南亚和东亚的印度尼西亚、菲律宾和中国；南美的哥伦比亚、巴西、玻利维亚和厄瓜多尔。

在亚洲和非洲，犬咬伤是狂犬病感染后人类死亡的主要原因。作为一个狂犬病流行的国家，斯里兰卡每年报告有20-30人死于狂犬病。狂犬病病毒主要存在于犬群中，斯里兰卡人类狂犬病病例的主要来源主要是家庭宠物犬和流浪犬，其中流浪犬最多。

动物狂犬病的预防完全基于疫苗接种。使用有效和安全的现代细胞培养衍生疫苗对动物群体(主要是犬)进行接触前免疫接种，可防止狂犬病感染，并因此防止其传播给人类。在西欧国家和北美，多年来一直对犬进行肠胃外免疫接种，从而消除了犬群中的狂犬病，同时降低了人类狂犬病的负担。暴露后，由狂犬病病毒引起的人类急性和进行性致命脑炎也可以通过及时实施暴露后预防(PEP)来预防。这已在世界上许多国家和地区得到证明。

在斯里兰卡，有证据表明，尽管以前接种过疫苗，但犬仍会患上狂犬病，并且在被接种过疫苗的犬咬伤后，已报告了人患狂犬病的病例(个人交流)。在其他国家，以前接种过疫苗的犬出现狂犬病阳性病例越来越多。这强调了一个事实，即为了有效控制狂犬病感染，抗狂犬病疫苗(ARV)不仅应该是安全的，而且应该是有效的，具有成功预防病毒感染和传播所需的效力。有一个即将到来的挑战:由于各种原因使用无效的疫苗。假冒疫苗生产的最新全球趋势就是这些挑战之一。越来越多的假冒狂犬病疫苗的供应和管理，尤其是在PEP中，也可能导致本来可以预防的人类狂犬病死亡。

狂犬病疫苗效力检测的常用试验是小鼠攻击试验，该试验基于美国国立卫生研究院(NIH)试验，包括用不同稀释度的疫苗对小鼠进行两次腹膜内免疫，然后脑内注射攻击病毒标准品(CVS)。

与许多国家一样，在斯里兰卡，人用和动物用狂犬病疫苗目前在没有任何具体注册程序的情况下销售，认为制造商的结果足以获得销售许可。这里要考虑的一点是，除了疫苗品牌本身的注册，控制将在该国上市的每一个批次也很重要，因为批次之间可能会有一些差异。本研究的目的是在法国ANSES南锡的欧盟/WOAH/世卫组织狂犬病参考实验室使用小鼠攻击试验，测试研究期间斯里兰卡所有市售兽用狂犬病疫苗的效力(价值)。

2.材料和方法

2.1.材料

2.1.1.测试疫苗

使用国家卫生研究所(NIH)的测试方法，对注册用于兽医用途并在斯里兰卡市场上销售的八种不同类型的灭活佐剂狂犬病疫苗的效力进行了测试。这包括六种单剂量、单价或二价制剂疫苗(Canvac™ R–dyn tec spol。S r.o，Terezin，捷克共和国，Defensor™ 3–Zoe tis，Rivonia，Sandton，南非，Nobivac狂犬病和Nobivac™ RL–inter vet International b.v .，Boxmeer，荷兰，狂犬病灭活疫苗–Komipharm International，京畿道，韩国，Rabisin™-Boehringer–Ingelheim(Merial)，德国)和one(Raksharab™-Indian immunological s ltd .，印度海得拉巴)的单剂量和多剂量制剂。七种疫苗为单价疫苗，一种疫苗为双价疫苗(狂犬病和钩端螺旋体病) (表1)。所有这些疫苗都是直接从相关供应商处购买的。从六个不同的供应商处购买了六个不同的品牌(Canvac™、Defensor™ 3、Nobivac、狂犬病灭活疫苗、Rabisin™和Raksharab™)。Nobivac狂犬病和Nobivac™ RL购自同一家供应商。单剂量Raksharab™和多剂量Raksharab™均购自单一供应商。所有八种疫苗都分别在斯里兰卡兽医药品管理局(VDCA)注册。这些疫苗以液体形式收到，并在科伦坡大学医学院生理学系储存6个月，储存温度为+4℃。储存温度受到定期监控，冷藏链在此储存期间没有中断。这些疫苗随后被运送到位于法国ANSES-南锡的欧盟/WOAH/世卫组织狂犬病参考实验室进行NIH效力检测。疫苗运输也是在+4℃下进行的，并有严格的观察。整个运输期花了三天时间才到达。所有疫苗的有效期在整个研究期间都有效。

表1.本研究中试验的狂犬病灭活疫苗的特性。

*挑战病毒标准。

2.1.2.参考疫苗

第五批生物参考制剂(BRP 5号)从欧洲药品和保健质量理事会(EDQM)获得。该制剂的指定滴度为每瓶10国际单位(IU )，是一种冻干疫苗，来源于Nil-2细胞系中产生的Pitman Moore (PM)狂犬病病毒株，用β-丙内酯灭活。BRP 5号储存在20℃下，使用前用1 mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)对每个小瓶进行再水合，以获得相当于10 IU/mL的溶液。

2.1.3.动物

雌性瑞士/OFI小鼠(Charles River Laboratory，Les Oncins，France)体重13-15克，用于分析。将动物随机分成每组10只小鼠的组(每组10只小鼠一个笼子)，如下所示:

4组来测试4个剂量的CVS攻击病毒(病毒的返滴定)。

4组试验4剂参考疫苗BRP N°5。

4组测试每种测试疫苗的4个剂量。

2.1.4.挑战病毒

用于动物实验的CVS-27由添加了抗生素和低百分比(2-5%)热灭活胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的20%小鼠脑悬液组成。它储存在800升的液氮小瓶中。

2.2.方法

2.2.1.NIH试验

按照欧洲药典专论0451。简而言之，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备待检疫苗和参考疫苗(BRP N°5)的四系列五倍稀释液。将每种稀释液分配给不同的10只小鼠组，并在第0天通过腹膜内途径给每只小鼠施用0.5 mL适当的稀释液(首先施用最高的稀释液)。根据疫苗的效力，参考疫苗的初始稀释度相当于1:1，测试疫苗的初始稀释度为1:4、1:1或纯的。免疫接种后14天，所有小鼠都被麻醉(Zoletil®，Virbac，France)并通过颅内途径用固定剂量的CVS-27病毒(50 LD50，0.030毫升)攻击。致死剂量50 (50 LD50)表明0.030毫升CVS悬浮液含有攻击病毒，当颅内接种时，该病毒可导致50%的小鼠死亡。平行地，通过颅内途径将0.030 mL的攻击悬浮液和3系列10倍稀释液注射到4个不同组(每组10只未接种小鼠)的每只小鼠中，以进行病毒的返滴定。每天监测动物的狂犬病临床症状，并按健康、患病或死亡进行评分。为了减少动物痛苦的持续时间，使用了人道的终点而不是致死性。动物被人道地实施了安乐死2中毒或颈椎脱臼)，当检测到对应于疾病3期的狂犬病典型临床症状时。

脑内接种后第一个四天内发生的动物死亡被认为是非特异性的，不能明确归因于狂犬病[9].

2.2.2.统计分析

NIH效力测试是基于一个全有或全无的反应。因此，使用了平行线模型，每个模型至少有3个点用于待检测的疫苗和BRP N°5。将每个稀释度下的存活率数据进行角度转换，并使用根据Combistats软件版本4.0(EDQM，欧洲委员会)验证的内部数据库比较BRP N°5和试验疫苗的线性化剂量/反应曲线，并确定效力估计值。

2.2.3.效力测试的验证

为了使效力检验结果有效，需要满足验证标准。50%保护剂量(PD50)应介于试验疫苗和参考疫苗的最大剂量和最小剂量之间。对于攻击病毒滴定，0.03毫升悬浮液应至少含有10 LD50。置信限应该在测定效力的25%和400%之间(p= 0.95)。CVS滴定和试验疫苗的统计分析应具有剂量/反应线的显著斜率。统计分析应显示与剂量/反应线的线性无明显偏差。试验疫苗和参考疫苗的剂量/反应线的平行性不应有任何显著偏差。最后，在每组中，在攻击后的前4天内死亡的小鼠不应超过2只。

如果满足所有这些条件，则可以确定受试疫苗的效力，如果根据欧洲药典-8.0，疫苗的估计效力等于或高于1.0 IU/剂，则认为该疫苗符合标准。

3.结果

六个品牌的单剂量制剂和一个品牌的单剂量和多剂量制剂的测试结果记录在中表2。在测试的疫苗中，共有四种单剂量制剂(Rabisin™、Raksharab™、Nobivac™ RL和Nobivac™ Rabies)符合在我们的条件下执行的NIH效价。Rabisin™的最高效价为12 IU/剂。Raksharab™单剂量、Nobivac™ RL和Nobivac™狂犬病的效价分别为7.2 IU/剂、4.4 IU/剂和3.4 IU/剂。Raksharab™多剂量制剂的效价为1.3 IU/剂；然而，该检测不符合验证标准，其中下限低于1.0 IU/mL的阈值。此外，估计的效价刚好高于阈值(1.3 IU/mL)。两种单剂量制剂Defensor™ 3和Canvac™的效力刚好低于阈值。最后，狂犬病灭活疫苗的效价为0.1 IU/剂。

表2.所测试疫苗的NIH效力测试结果。

4.讨论

2015年，世界动物卫生组织、世界卫生组织和联合国粮食及农业组织与全球狂犬病控制联盟合作，制定了到2030年犬传播的人类狂犬病零死亡的全球目标。在2019年的第一份年度进展报告中，他们表示，第一个目标是“通过有效使用疫苗、药物、工具和技术来消除狂犬病”。到2030年消除犬传播的人类狂犬病的战略计划包括通过犬疫苗接种运动成功控制犬狂犬病，因为每年全球60，000例人类死亡几乎全部是由犬造成的。为了实现这一目标，强效疫苗和药物是绝对必要的。为此，狂犬病疫苗制造商应进行许多过程质量控制，包括鉴别、纯度、无菌性、安全性、灭活和效力。世卫组织和WOAH建议，用于人和动物的狂犬病疫苗应由主管当局批准，并符合国家或国际相关标准。监管部门还应在审批过程中对商用疫苗的质量进行独立核查。目前，这是通过使用世卫组织50多年前采用的NIH效价测试来实现的。这种体内测试最初是由美国国立卫生研究院(美国马里兰州贝塞斯达)开发的。它使用用狂犬病病毒攻击的免疫小鼠来测量人灭活狂犬病疫苗所赋予的保护。它是通过间隔7天给小鼠接种两次疫苗，然后进行颅内攻击来进行的。效力试验在ANSES南锡的欧盟/WOAH/世卫组织狂犬病参考实验室对我们的兽用狂犬病疫苗进行，是欧洲药典专论0451中描述的小鼠疫苗接种激发试验方法，源自NIH试验。它是基于在第0天对小鼠进行单次接种，然后在接种后14天以每10只动物一组的疫苗稀释液进行颅内攻击，以达到3Rs的第一步。

目前在斯里兰卡市场销售的兽医用ARV有七个品牌。在2016年，在该研究的规划和获得伦理批准期间，没有既定的程序在上市前由斯里兰卡兽药管理局(VDCA)测试狂犬病疫苗批次的效力。即使是现在，该国也没有现成的设施来进行NIH测试、其他血清效价测定，或在兽用狂犬病疫苗投入使用前对其进行任何质量控制。

这是第一项评估斯里兰卡目前使用的兽医疫苗质量的研究。在我们测试的单价疫苗中，发现Rabisin™、Raksharab™、Nobivac™ RL和Nobivac™狂犬病疫苗符合NIH效价。单价疫苗Canvac™ R、Defensor™ 3和狂犬病灭活疫苗不符合NIH效力测试。根据NIH测试结果，这些疫苗的效力低于阈值水平。在用狂犬病灭活疫苗进行的试验中，几乎所有的小鼠在每个稀释度中都死于狂犬病，包括纯稀释度。这种疫苗似乎不能提供任何预防狂犬病感染的保护。根据验证标准对这七种单剂量制剂的NIH试验进行了验证。尽管Raksharab™多剂量制剂的效价值为1.3 IU/剂，但该试验不符合验证标准，因为估计效价的下限低于1 IU/剂，这意味着我们无法利用该结果。不幸的是，我们无法对这种疫苗进行重复检测，因为我们的合作实验室——位于法国ANSES南锡的欧盟/WOAH/世卫组织狂犬病参考实验室——已经完全停止了NIH效力检测，取而代之的是血清效力检测(SPA )，这是一种定性检测。即使我们使用SPA重复测试，我们也只能获得定性结果，而不能获得效价值的准确水平。除Raksharab™外，我们还收到了Canvac™的多剂量制剂。由于批号与单剂量制剂的批号完全相同，因此未进行效价测试。这是为了防止不必要的使用动物，同时尊重3r原则。在Servat等人进行的研究中，2015年[9]，通过使用改良的快速荧光焦点抑制试验(mRFFIT)和荧光抗体病毒中和试验(FAVNt )，使用血清学效力试验(SPA)对大量不同的狂犬病疫苗进行了测试。在这项研究中，在测试的七个不同疫苗组中，他们有四类疫苗效力:高、中、低IU/剂量(接近1 IU/剂量的阈值)和低于阈值(效力低于1 IU/剂量)。这表明每个疫苗品牌的疫苗效力可能不同。

疫苗之间抗原值的差异，可能是由于生产过程中使用的抗原浓度较高或较低，可能是每种受试疫苗效价差异的原因之一。NIH测试是一种可变的方法。有时，一天的BRP有效剂量50 (ED50)的0.3对数变化可以将试验疫苗的效力除以或乘以2。这是因为NIH测试是一种旧方法，几十年来没有得到改进，因此具有很高的可变性。此外，这种测试还有一些其他的缺点，例如成本高、耗时、需要大量的动物，并且会给动物带来很大的痛苦。EDQM认识到血清效价测定是小鼠攻击的替代方法，该方法已在一项合作研究中采用。SPA基于mRFFIT或FAVN试验，减少了所用动物的数量以及与NIH试验程序相关的疼痛和痛苦程度，符合3Rs原则。其他技术，如ELISA，目前正在开发和验证中，这也是NIH检测的一种替代方法。

第一项研究的结果表明，在向市场投放商业批次之前，对ARV的效力进行评估似乎是必要的/强制性的，因为在斯里兰卡商业化的几个品牌的疫苗似乎不符合小鼠效力测试。这项研究将不得不对其他批次的相同疫苗进行重复，以充分验证这些初步结果。然而，这些结果是令人感兴趣的，因为全世界都在关注假冒或低质量人用疫苗的销售，这导致了无效疫苗的施用。这使得儿童和成人在不知不觉中生活在没有保护的情况下，无法预防这种可预防的疾病。这些疫苗的售价往往比正品更实惠。这也是发展中国家面临的一个风险，在这些国家，疾病负担最重，疫苗不容易获得，而且可能过于昂贵。据报道，2010年，包括儿童在内的1600多人接种了假冒的人用狂犬病疫苗。研究还报告了与疫苗储存和疫苗效力相关的假冒动物疫苗的风险。泰国畜牧发展部和美国食品药品监督管理局报告发现了2016年从西班牙进口的用于动物的不合格狂犬病疫苗。所有这些报道的数据，加上本研究的结果，证实了在将狂犬病疫苗投放市场用于接种成千上万只犬之前评估其效力的重要性。

在欧洲，由欧洲药品和医疗质量管理局(EDQM)开发的官方控制授权批签发被几个成员国使用。它包括监管机构签发官方证书，证明该批次在上市前进行的效价测试符合独立机构测试后的国际或国家效价要求。这种证书可以被其他国家认可，以避免使用动物进行试验。这种基于批次控制的系统阻止不再通过资格预审的人用和兽用疫苗在世界市场上销售。进口未经资格预审的人用和动物用疫苗的国家的政府应实施类似的系统，在疫苗到达和使用前检查疫苗效力。此外，应强制疫苗制造商提供每批出口疫苗的效价数据。

除了在使用前测试疫苗效力之外，监管机构还可以采取一些其他措施来最大限度地减少和防止无效和假冒动物疫苗的使用。一个是WOAH狂犬病疫苗库，它确保采购按照WOAH国际标准生产的高质量犬疫苗。

这项研究报告了在斯里兰卡上市的特定批次兽用狂犬病疫苗的效力试验数据，这些疫苗主要用于狂犬病疫苗接种项目中的犬。结果表明，七批不同疫苗中有三批不符合效力的国际要求。有必要对这些疫苗的其他批次进行进一步测试以确认结果。该研究显示，在该国销售的一些批次的狂犬病疫苗不符合必要的要求。此外，我们正在进行一项研究，以确定这些疫苗赋予实验室兔子和野犬的体液免疫发展。免疫，随后测量抗体滴度，将为我们提供数据，我们可以使用这些数据来重新评估和验证疫苗的效力测试结果，并允许在效力测试和体液反应之间进行比较。由于在斯里兰卡没有国家卫生研究院对兽用狂犬病疫苗进行检测的设施，一种替代方法是使用合适的实验室动物模型，根据抗逆转录病毒药物的免疫原性来评估其相对效力。然而，世卫组织的建议是在精心设计的现场研究中评估免疫原性。

斯里兰卡国家当局目前正在制定一项基于单一保健方法的2022-2026年消除犬传播的人类狂犬病国家战略计划。该计划的一个主要组成部分将是增加犬狂犬病疫苗接种覆盖率；因此，这项研究将有助于主管当局组织和实施犬大规模注射疫苗。国家政府应确保进口疫苗符合国际效力标准，防止低质量疫苗和不受监管的产品进入市场。如果动物狂犬病疫苗符合质量和效力的国际标准，则应使用这些疫苗，这将最终有助于实现到2030年犬传播的人类狂犬病零死亡的全球愿景。

Rathnadiwakara H， Gunatilake M， Servat A， Wasniewski M， Thibault JC， Cliquet F. Potency of Veterinary Rabies Vaccines Marketed in Sri Lanka. Vaccines (Basel). 2023 May 9;11(5):961. doi: 10.3390/vaccines11050961. PMID: 37243065; PMCID: PMC10222363.