在细胞里 tdTomato有严重的aggregation,不过在细胞质里也还是有弥散状分布的tdTomato.但是似乎bleaching 和quenching只发生在弥散分布的tdTomato蛋白里,aggregation的亮点似乎没有太大的荧光衰减.难道aggregation有助于蛋白稳定?更稳定的结构保证荧光集团的稳定?
在ZIESS网页: zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/probes/anthozoafps.html (page 3/18)中提到
最初的DsRed是四聚体,荧光较稳定,但是不适合实际应用.在实验室产生单体RFP(red fluorescence protein)非常难,使用了不断突变.第一代单体RFP荧光较弱,而且非常容易photobleaching.RFP和DsRed主要区别就是一个是单体一个是四聚体.看来寡聚化(oligomerization)对荧光稳定性是有帮助的.
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(1)pH
今天我测了所有接触样品的试剂的pH.固定液多聚甲醛PA,和Carboiimide(EDC),以及清洗试剂PB都是pH7.4,在这个pH mCherry应该是稳定的.所以我想pH的因素可以排除.
(2)光强
试试减弱激发光的光强.
按照今天的实验结果来看,光强是目前影响最大的因素.
以前小水獭想尽量减少曝光时间,总觉得曝光时间越长,荧光衰减越快.
但是减弱光强,单位时间内荧光集团接受能量减少,从今天的结果来看,是有利于荧光的稳定的.
(3)抗氧化剂
谢谢徐磊的指点,提醒我还有一条路就是加抗氧化剂.
在Tsien R 1998 的review里也提到了Trolox, 维他命E衍生物,可用于荧光保护.
"Cell-permeant antioxidants may be helpful in protecting such GFPs from
bleaching. An example is Trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-
carboxylic acid, a water-soluble vitamin E analog commercially available from
Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI."
我搜到了另一篇文章
Campos LA, Liu J, Wang X, Ramanathan R, English DS, Munoz V (2011) A photoprotection strategy for microsecond-resolution single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature methods 8:143-146
是使用Trolox的.
(4)封片试剂 mounting medium
Tsien 1998 里提到了FPs对酸和有机试剂敏感,我就开始紧张封片试剂mounting medium了.
刚好搜到下文:
Malkani N, Schmid JA (2011) Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation. PLoS One 6:e18586.
文章用CFP和YFP测试两种封片试剂来自于Dako和ultramount,不过我们实验室用的是Vector公司的mountingshield.文中提到,目的是保护荧光的封片试剂,其中的有机溶剂,主要是甘油glycerol可能会影响FP.
文中还提到最佳的保护溶剂是PB:glycerol=1:7.小水獭腹黑的笑了,以为找到了终极秘籍.
今天小水獭对照试验了三种封片试剂(1)PB,(2)mounting medium (3) PB+glycerol,坑爹啊!!!!!!!!!!!!!
PB最好,mounting medium 其次,他们建议的PB+glycerol最不灵,片子毁得一塌糊涂,背景高的吓人.信号却没了
不过目前小水獭认为,对fixed tissue,封片试剂确实不能提高荧光稳定性,哦..........还不如PB.
但是对于化学合成的抗体偶联荧光分子,比如Alexa,Texasred 系列,封片试剂应该是有帮助的.
(5)新鲜配置4%PA
Dr.Pan建议以后最好每周新配PA,小水獭想也许应该这样的.
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