按：经过多年的研究和实践，我在2007年提出了“构建Nema-log 植物线虫分子标记系统的设想”，但以我个人的眼识，还很难判断此标记系统的自身价值和生命力，所以上传至此，恳请诸位指点赐教。

关于构建Nema-log 植物线虫分子标记系统的设想

 

摘要：植物寄生线虫种类繁多，危害严重，鉴定困难。本文根据其他学者以及本实验室的实验数据，提出了构建Nema-log 植物线虫分子标记系统的设想。虽然要想建成Nema-log系统会困难重重，而且也注定是长路漫漫，但是该系统具有广阔的应用前景。

关键词：ITS;RFLP;PCR;限制性内切酶

背景

Poinar(1983)估计地球上有线虫约50万种，其中约有10%是植物线虫，已知种类约15,000种。目前世界上已记载的植物线虫约有200多属5000多种^[1]。2007年农业部862号文件公布的中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录中，植物寄生线虫有20种类，约160种^[2]。

据2000年的统计，全世界因线虫危害给粮食和纤维作物造成的损失约为12.7%，对蔬菜、花生、烟草和某些果树造成的损失超过20%。因此，线虫已成为植物的一类重要的病原物，线虫病害已成为农林生产上的重要问题^[3]。

植物线虫危害如此严重，但是由于种类如此繁多，所以植保工作者要想对线虫进行快速准确的鉴定非常困难，对于基层、口岸等经验不足，水平不高的工作人员尤其如此，从而进一步阻碍了农业防治措施的运用或检疫处理措施的实施。

为解决上述问题，我们提出构建Nema-log植物线虫分子标记系统。

概念

  

D. dipsaci genotype DI1            D. dipsaci genotype DI2             D. myceliophagus genotype DM1

植物线虫的Nema-log标记

1为PCR扩增产物、2-6依次为RsaI、HaeIII、MspI、HinfI、AluI的酶切片段、Marker

 

Nema-log植物线虫分子标记就是以核糖体rDNA上的串联重复序列ITS或者其它序列为目标片断^[4]，通过PCR方法扩增放大，最后将PCR扩增产物通过一组特定的限制性内切酶进行消化（RFLP），最后将酶切消化后的产物通过水平槽凝胶电泳分离，然后EB染色，凝胶成像而获得的分子图谱。

技术路线的设计

我们提出的Nema-log植物线虫分子标记系统主要包括5项技术内容：

1.单条植物线虫DNA微量提取；

2.目标DNA片断的选择以及PCR扩增；

3.扩增产物量的快速检测；

4.限制性内切酶组合的选择；

5.PCR产物的限制性酶切及Nema-log植物线虫分子标记的获取。

关键技术的解决

1998年以来，南京农大植物线虫实验室、天津出入境检验检疫局植物检疫实验室与德国联邦农林研究所（BBA）一直保持密切的联系与合作，通过近10年的努力已经基本解决了该系统需要的关键技术：

1.已经成功的建立了单条植物线虫DNA微量提取技术^[5]，并且经过了实践检验；

2.通过多年的数据，基本锁定目标片断为核糖体rDNA上的内部转录间隔区序列ITS，并建立了伞滑刃属、粒属、茎属、类短体属、短体属、矮化属、根结属等线虫的rDNA-ITS序列的常规PCR或套式PCR扩增体系；

3.扩增产物的检测采用凝胶电泳或荧光染色法进行；

4. 限制性内切酶组合的选择采用Webcutter2.0软件辅助与实验相结合的方法进行，更加快速、便捷。

 

存在的问题

    毫无疑问，没有任何一项技术或技术平台能够一劳永逸的解决所有问题，Nema-log在解决植物线虫的分子标记问题上也同样面临这样的问题。比如，在根结线虫中，南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫3种常见的根结线虫ITS序列几乎完全一致，所以这3种根结线虫的分子标记应该选择其它的核酸序列作为目标片断。完全相反，拟松材线虫的亚洲地理种群和欧洲地理种群在形态上差异细微，只是尾尖突略有不同，从形态学上以及更多的致病性、生物学、寄主范围等方面应该认定为同一个种，但ITS核酸序列的差异为5%，从而在最终的分子标记上表现一定的差异。这就说明，尽管几率很低，但无疑一个Nema-log标记可能对应着不同的物种，而1种线虫也有可能对应着多个相近但有差异的Nema-log标记。而且伴随着研究的深入Nema-log标记数目的不断增加，Nema-log标记还有可能碰到更多类似的问题。因此，Nema-log植物线虫分子标记系统在目前以ITS为目标片断的基础上，应该不断深入研究以挖掘其它的目标片断，作为ITS序列不足的补充。

 

展望

    任何事物都有一个发生发展的过程，以ITS序列为基础的Nema-log分子标记系统同样也面临许多的难题。但是我们应该看到，Nema-log系统的优势所在。首先，Nema-log系统能够解决绝大多数植物线虫物种的标记问题，该技术在伞滑刃属线虫中的成功就是很好的例子；其次，Nema-log系统中所涉及的技术成熟、操作简单，一般工作人员经过1-2周的训练就可独立操作；第三，该方法所用引物较少，目前只有3条就基本解决问题，免去了引物大量合成的成本和管理保存的麻烦。我们的目标就是要将该系统的引物控制在10对以内，限制性内切酶控制在20个以内。

    在Nema-log系统的发展过程中，自动化是一个必然选择。这其中必然涉及到试剂盒的开发，如，单条线虫DNA微量提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、酶切试剂盒等的开发。同时，伴随着Nema-log系统植物线虫分子标记数目的不断增加，实现对图谱数据的自动化采集以及未知线虫分子标记图谱与数据库中标准图谱的自动化比对同样是一个必然的选择。

    Nema-log系统的建立需要大量的科研人员的广泛参与，它不可能由某个个人或某个实验室独立的完成，因此在Nema-log系统的标准标记数据库的建立过程中应该建立Nema-log标记获取的标准化程序，从而使每一个参与该项工作的科研人员提供的标记图谱具有标准化意义，或者能够开发出计算机软件能够将不同的非标准化标记图谱进行标准化处理也是很好的选择。

    不过，虽然要想建成Nema-log系统会困难重重，而且也注定是长路漫漫，但是该系统具有广阔的应用前景。一旦建成，必将在以下4个方面发挥重要作用：

1.为我国农业植物保护工作者在植物线虫种的水平上的鉴定提供重要的辅助，以克服形态鉴定的不足；

2.为我国口岸植物检疫人员的线虫快速鉴定提供重要支持；

3.为植物线虫研究人员发现新的物种提供重要依据；

4.为植物线虫分类学中同物异名、异物同名等现象的澄清提供帮助。

 

参考文献

[1]谢辉.植物线虫分类学(第二版).北京：高等教育出版社.2005, 2.

[2]中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录. 农业部862号文件，2007

[3]刘维志.植物线虫志.北京：中国农业出版社.2004, 2.

[4]Powers T O, Todd T C, Burnell A M, et al. 1997, The rDNA internal transcribed spacer region as a taxonomic maker for nematodes [J]. Nematol., 29:441-450.

[5]WANG Jin-Cheng, YU Ben-Yuan, LIN Mao-Song. Description of a new species (Nematoda, aphelenchoididae) isolated from wood packaging material. Acta Zootaxonomica, 30(2): 314～319.

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