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[转载]新冠病毒抗体血清学检测与中和抗体定量实验方法

已有 6599 次阅读 2021-7-21 23:31 |系统分类:科研笔记|文章来源:转载

    1. 第一类检测结合抗体,常用的实验方法有酶联免疫分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)、胶体金免疫层析分析(gold immunochromatography assay,GICA)等,这类检测的优点是相对简单便捷,对实验要求低,不需要使用到活病毒,缺点是通常只能检测总结合抗体,但不能检测中和抗体。


(1)GICA方法操作简单、快速,使用标本量小,仅需10-15μl血液样本,约15分钟内即可通过肉眼观察获得结果,不需要大型仪器设备,对操作流程和实验室环境要求不高,也被用作床旁检测(point of care testing,POCT)和流行病学监测的重要手段。胶体金检测法虽然简单快速,但灵敏度较差、准确性不高,无法定量,但是对实验室和人员要求较低,适用于快速初步筛检。目前获得国家药品监督管理局批准的生产厂家有北京新兴四寰、珠海丽珠、上海芯超、广州万孚、英诺特(唐山)、南京诺唯赞、广东和信,与GICA类似的免疫层析方法还有北京金豪制药股份有限公司研发的量子点荧光免疫层析法、厦门奥德生物科技有限公司的稀土纳米荧光免疫层析法、北京热景生物技术股份有限公司的上转发光免疫层析法。


(2)ELISA是最常用的抗体检测方法,不仅具有较好的敏感性和特异性,同时还具有易标准化、操作方便、能快速获得结果等优点。国内上市的ELISA方法有北京华大吉比爱研发的IgM/IgG抗体检测试剂盒。ELISA方法特性性较强,对设备要求低,在具有相应技术的各种规模实验室均可开展,但因需要酶的结合所以需要较长时间的孵育,因此检测试剂长,且单次检测通量有限,操作环境开放,易污染,通常只能定性或半定量检测。


(3)CLIA法是近几年发展起来的酶联免疫方法,其优点是操作方便,结果稳定,人为因素少,但需要专门的仪器和配套的试剂进行操作。目前已获批的CLIA试剂包括厦门万泰凯瑞、博奥赛斯(重庆)、博奥赛斯(天津)、深圳市亚辉龙、郑州安图、丹娜(天津),检测原理为磁微粒化学发光法,另外还包括迈克生物的直接化学发光法检测平台。CLIA方法特异性强,能够对SARS-CoV-2抗体水平进行定量检测,但需要特殊的设备,检测成本相对较高,适宜在具有一定规模、有化学发光免疫分析仪的实验室开展。




   2.第二类是检测和定量血液样本中功能性抗体(中和抗体,neutralizing antibodies,NAb)。中和抗体无疑是获得性体液免疫的一个关键因素,在保护我们免受SARS-CoV-2感染方面发挥重要作用。中和抗体可能是IgG、IgM、IgA等,但不是所有的IgG、IgM、IgA都是中和抗体,二者不能完全划等号。目前已上市的IgG、IgM检测试剂盒主要用于临床感染的辅助鉴别诊断,并不能用于病毒的中和抗体检测。检测中和抗体的实验方法包括VNT(virus neutralization test,病毒中和试验)和pVNT(假病毒中和试验)等。前者又包含PRNT(蚀斑减少中和试验,plaque reduction neutralization test)和微量细胞中和试验(MRNT),其中PRNT是中和抗体检测的金标准(又分PRNT50和PRNT90),但缺点是耗时长,需要3~5天时间,由于用到活的新冠病毒(SARS-CoV-2),有感染风险,必须在P3实验室才能开展PRNT。


(1)PRNT对病毒蚀斑进行计数,在每个选定的病毒活性降低百分比(通常为50%或90%)下,计算PRNT终点滴度。作为金标准 "gold standard",PRNT的缺点是劳动强度大,不易适应高通量,因此难以用于大规模的监测和疫苗试验。由于SARS-CoV-2的高致病性和传染性,所有使用活病毒评估相关试验都必须在生物安全三级(BSL-3)实验室进行。


(2)MRNT通过在微孔板中观察细胞病变,获得能保护50%细胞不被感染抗体滴度。此方法更适合处理大量

样品。但是,所有病毒中和试验均涉及到活病毒的操作,对于新冠病毒来说,只能在BSL3实验室环境中进行,这极大地限制了可以操作这些实验的实验室的数量。


(3)pVNT(pseudovirus virus neutralization test)将慢病毒(或水泡型口炎病毒VSV)的包膜蛋白用新冠病毒的Spike蛋白替换,模拟新冠病毒感染。假病毒无完整的活病毒成分,只能进行一轮复制。相对于PRNT和MRNT方法,pVNT是一种灵敏、准确、重复性好的方法。SARS-CoV-2假病毒以复制缺陷型的HIV-1病毒为骨架,包被SARS-CoV-2的表面刺突糖蛋白(Spike glycoprotein),通过Spike 蛋白受体结合区域(Receptor-binding domain, RBD)与人血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)受体结合,感染过表达人ACE2的细胞,模拟病毒入侵细胞过程。由于假病毒只能单次感染,无法复制,因此可在生物安全2级(BSL-2)实验室内操作和使用。


    SARS-CoV-2(2019-nCoV)是有包膜的单链RNA病毒,包含四个结构蛋白:膜(M),包膜(E),刺突(S)和核衣壳(N)。新冠病毒的刺突蛋白(Spike, S)蛋白被认为是诱导中和抗体的主要抗原。中和抗体作用机制一般包括改变病毒表面构型;与吸附有关的病毒表位结合,阻止病毒吸附,使病毒不能侵入细胞进行增殖;与病毒形成免疫复合物,易被巨噬细胞吞噬清除;有包膜病毒的表面抗原与中和抗体结合后,激活补体,可导致病毒的溶解。目前已建立的基本都是基于ELISA等技术的免疫检测方法, 虽在用于评估疫苗免疫后产生的保护性免疫应答或患者体内的保护性免疫应答。但都是针对S蛋白特定区域的结合抗体而非真正的中和抗体,也就难以预测抗体对病毒的中和作用以及对宿主的保护效果。评估SARS-CoV-2疫苗诱导的中和抗体的最直接方法是使用活病毒的感染中和试验或感染抑制试验,但是活病毒的操作必须在BSL-3实验室中进行,受实验条件和病毒来源等因素的限制。另外, 由于病毒株,培养条件和结果解释标准的不同,不同实验室的活病毒检测结果常常存一定的差异。假病毒中和抗体检测方法(Pseudovirus-based neutralization assays, PBNAs)作为一种替代的、概念验证性的检测手段,在目前的疫情形式下具有较高的实用价值。2020年8月15日,国家药监局药审中心发布新冠疫苗研究的5个指导原则,假病毒检测中和抗体检测方法被写入《新型冠状病毒预防用疫苗研发技术指导原则 (试行)》、《新型冠状病毒预防用疫苗临床研究技术指导原则(试行)》,用于新冠疫苗临床前和临床试验免疫原性评价。中和抗体检测方法需要经过严格的标准化过程和充分的性能评价,并通过确定适合的判断界值(Cut-off值),建立与病毒保护力之间的相关性,确定最低保护水平。例如已经较为成熟的流感疫苗、EV71疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎疫苗等,均已建立了WHO认可的标准化的中和抗体试验,有相应的WHO标准品和推荐使用的标准毒株,并设定了明确的Cut-off值。其他疫苗,即使尚没有国际公认的参考方法,各疫苗厂商也需要建立相对标准化的中和抗体试验方法。另外,值得注意的是,体液免疫并不是疫苗接种后产生保护力的唯一途径,除了中和抗体(体液免疫)之外,细胞免疫等其他免疫途径也同时发挥作用。因此接种疫苗后中和抗体滴度水平低或者检测阴性,并不能明确得出没有保护力的结论。对疫苗保护力的评价应结合体液免疫与细胞免疫等进行综合判断。


  假病毒(Pseudovirus)系病毒衣壳蛋白或者包膜蛋白包裹携带有报告基因的异源重组病毒载体核酸为骨架形成的类似于真病毒的病毒颗粒,故能够模拟病毒入侵细胞的过程。但被包裹的核酸不具有复制形成病毒的全部核酸序列的能力,因此无感染及致病性生物安全隐患。与活病毒法相比,pVNT法操作更简单、安全。目前, 假病毒体系主要有:①基于鼠类白血病病毒(Murine leukemia virus ,MLV)等反转录病毒载体构建的假病毒体系;②以慢病毒(如HIV-1)载体为基础发展起来的假病毒构建体系;③基于水疱性口炎病毒(VSV)的假病毒体系等。以慢病毒载体为基础的假病毒不同于通常反转录病毒载体, 对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

    当携带有萤火虫荧光素酶报告基因(Fluc报告基因)的假病毒表面S蛋白与检测细胞受体结合后,Fluc报告基因进入宿主细胞,表达报告基因产生荧光素酶,催化底物发光。当样本中存在中和抗体时,中和抗体通过与S蛋白结合,阻断S蛋白与宿主细胞表面受体结合,从而阻止假病毒不能感染宿主细胞,Fluc报告基因无法表达荧光素酶。萤火虫荧光素酶催化底物发光强度与中和抗体的含量呈负相关的关系,通过检测宿主细胞表达Fluc报告基因荧光素酶所催化底物的发光强度,可以评价中和抗体的活性。或者采用带有GFP报告基因的假病毒,观察GFP 表达并记录GFP 阳性细胞百分率。用1 %~ 10% GFP 表达/ 孔的2019-nCov假病毒量进行中和滴定试验。到目前为止,国内外已有超过 200 篇使用假病毒的新冠研究论文上线,其中不乏 NEJM、LANCET、 CNS 等顶尖期刊论文。多位院士领衔的顶尖团队所发表的关于新冠病 毒中和抗体及新冠疫苗的研究工作均使用了新冠假病毒。另外,还有sVNT(s代表surrogate)等新的方法也用于中和抗体检测。



假病毒(pseudotyped virus)和活病毒(真病毒)之间的主要区别: 

  • 假病毒进入细胞后只能完成单个复制周期,这比活病毒更安全。

  • 假病毒仅包含SARS-CoV-2的S蛋白。因此,假病毒系统只能评估针对S蛋白的中和抗体效价,而不能评估其它结构或非结构蛋白诱导产生的中和抗体, 当然除S蛋白之外的其它病毒蛋白是否可以诱导中和抗体尚存在争议。

  • 假病毒感染细胞后,它无法完成与活病毒相同的生命周期,因此无法评估疫苗或药物在病毒进入细胞后, 对其复制的抑制作用。

  • 假病毒颗粒表面上S蛋白的数量可能会影响中和抗体检测试验的灵敏度, S蛋白的数量是否与活病毒相当还需要进一步研究。

  • 假病毒检测系统在建立和应用时,有必要与活病毒进行比较和验证,以确保其对活病毒检测方法的可替代性与可比较性。


sVNT(替代病毒中和试验) (Surrogate Virus Neutralization Test)

      GenScript生物技术公司最近介绍了这种用于检测血清中的COVID-19中和抗体的方法。该sVNT系统完全废除了活病毒和活细胞的使用,而是采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测辣根过氧化物酶(HRP)结合的重组SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域(RBD)片段(HRP-RBD)与人ACE2受体蛋白(hACE2)在固相上的相互作用。该系统可通过(标本里)的抗SARS-CoV-2 S蛋白的RBD的中和抗体,阻断HRP-RBD与hACE2蛋白的相互作用。首先,样品和对照品与HRP-RBD预孵育,以允许样品与阳性对照品中的抗体与HRP-RBD结合。然后将混合物加到包被有hACE2蛋白的捕获板上。未结合的HRP-RBD以及任何与非中和抗体结合的HRP-RBD将被捕获在平板上,而中和抗体-HRP-RBD复合物则留在上清液中,并在洗涤过程中去除。洗涤步骤后,加入TMB溶液,使颜色变蓝。通过加入停止溶液,反应停止,颜色变黄。在450nm的微滴定板上可读取最终滴定度。样品的吸光度与抗SARS-CoV-2中和抗体的滴度成反比。

      与基于细胞/病毒的系统(如PRNT和pVNT)相比,sVNT更安全、更易于操作、耗时更少—一小时即可完成。基于细胞/病毒的测试花费的时间较长,这是由于培养所花费的时间。这可能是一种潜在的非常有用的方法,可用于在大人群中进行中和抗体筛查,以调查保护性免疫和疫苗接种效果,而基于细胞/病毒的试验方法则无法达到这一目的。   

      sVNT这样的快速检测在大规模筛选中的潜在应用价值是有吸引力的,但是检测试剂的开发人员在对试剂进行验证时需要非常小心,因为重组的S蛋白受体结合域的构象很可能与天然蛋白不同,因此,其抗体结合能力可能与天然抗体一样,从而导致不正确的检测结果。



新冠假病毒包装方法:
1. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.
Emerging Microbes & Infections
https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1743767  
  Pseudoviruses are useful virological tools because of their safety and versatility, especially for emerging and re-emerging viruses. Due to its high pathogenicity and infectivity and the lack of effective vaccines and therapeutics, live SARS-CoV-2 has to be handled under biosafety level 3 conditions, which has hindered the development of vaccines and therapeutics. Based on a VSV pseudovirus production system, a pseudovirus-based neutralization assay has been developed for evaluating neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 in biosafety level 2 facilities. The key parameters for this assay were optimized, including cell types, cell numbers, virus inoculum. When tested against the SARS-CoV-2 pseudovirus, SARS-CoV-2 convalescent patient sera showed high neutralizing potency, which underscore its potential as therapeutics. The limit of detection for this assay was determined as 22.1 and 43.2 for human and mouse serum samples respectively using a panel of 120 negative samples. The cutoff values were set as 30 and 50 for human and mouse serum samples, respectively. This assay showed relatively low coefficient of variations with 15.9% and 16.2% for the intra- and inter-assay analyses respectively. Taken together, we established a robust pseudovirus-based neutralization assay for SARS-CoV-2 and are glad to share pseudoviruses and related protocols with the developers of vaccines or therapeutics to fight against this lethal virus.


2. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2.
Genes & Diseases
DOI: 10.1016/j.gendis.2020.07.006
https://doi.org/10.1016/j.gendis.2020.07.006

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the causative virus of the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic. To establish a safe and convenient assay system for studying entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2, we constructed a codon-optimized, full-length C-terminal mutant spike (S) gene of SARS-CoV-2. We generated a luciferase (Luc)-expressing pseudovirus containing the wild-type or mutant S protein of SARS-CoV-2 in the envelope-defective HIV-1 backbone. The key parameters for this pseudovirus-based assay, including the S mutants and virus incubation time, were optimized. This pseudovirus contains a Luc reporter gene that enabled us to easily quantify virus entry into angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)-expressing 293T cells. Cathepsin (Cat)B/L inhibitor E−64d could significantly block SARS-CoV-2 pseudovirus infection in 293T-ACE2 cells. Furthermore, the SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus could be neutralized by sera from convalescent COVID-19 patients or recombinant ACE2 with the fused Fc region of human IgG1. Thus, we developed a pseudovirus-based assay for SARS-CoV-2, which will be valuable for evaluating viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against this highly pathogenic virus.

 3. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay
Nature Protocols 
https://www.nature.com/articles/s41596-020-0394-5

Pseudotyped viruses are useful virological tools because of their safety and versatility. On the basis of a vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped virus production system, we developed a pseudotyped virus-based neutralization assay against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in biosafety level 2 facilities. Compared with the binding antibody test, the neutralization assay could discriminate the protective agents from the antibody family. This protocol includes production and titration of the SARS-CoV-2 S pseudotyped virus and the neutralization assay based on it. Various types of samples targeting virus attachment and entry could be evaluated for their potency, including serum samples derived from animals and humans, monoclonal antibodies and fusion inhibitors (peptides or small molecules). If the pseudotyped virus stock has been prepared in advance, it will take 2 days to get the potency data for the candidate samples. Experience in handling cells is needed before implementing this protocol.



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