Hydrogen Improves Glycemic Control in Type1 Diabetic Animal Model by Promoting G.pdf

氢气具有胰岛素样效应，可以治疗一型糖尿病。

关于氢气的效应，研究最充分的是其抗氧化效应，但对其他生物学效应，特别是细胞内信号分子的影响研究并不深入。最近日本学者在Plos One发表一篇文章，证明氢可以通过促进胰岛素受体以及下游信号分子，促进葡萄糖的摄取。

该研究最显著的特点是开展了高中低三种跨度较大的剂量效应分析，对不同层次的细胞内信号分子进行了分析，开展的细胞学研究也很具有特色。但文章也出现一些结果和过去的报道存在冲突，例如发现对肥胖没有效果（太田教授报道有抗肥胖效果）。而且对氢气为什么存在多位点的生物学效应没有给出合理的解释，对不同细胞存在不同效应也没有深入分析。但无论如何，这一研究是氢分子医学领域相对高质量的研究，建议全文认真阅读。

介绍如下

糖尿病（DM）的特征是异常的胰岛素分泌、碳水化合物脂质代谢紊乱和慢性高血糖。DM的总人数2000年为1.71亿，预计2030年将达到3.66亿。因此，治疗糖尿病的各种疗法，包括替代医学一直受到临床研究的重视。胰岛素样生长因子1（IGF-1）的生理效应和胰岛素类似，曾经一度认为可以代替胰岛素治疗糖尿病，但是最近的研究发现IGF-1可以导致糖尿病性视网膜病变。进行性糖尿病目前唯一的治疗方式仍是胰岛素。

胰岛素通过结合肝脏和肌肉等细胞膜上特异性胰岛素受体发挥作用，胰岛素受体的作用方式符合典型的受体酪氨酸激酶模式，结合胰岛素-受体激活，磷酸化受体后底物，产生效应。胰岛素受体是由一个异型四聚体膜蛋白。由两个细胞外a亚单位和两个跨膜的b亚单位通过二硫键连接组成。胰岛素与细胞外a亚单位结合，导致b亚单位自身磷酸化，激活b亚单位细胞内的酪氨酸激酶域。激活的胰岛素受体（酪氨酸激酶）使将胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRSs)上具有重要作用的十几个酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的IRSs能够结合并激活下游效应物如PI3K。有学者把胰岛素受体、胰岛素受体底物和PI3K称为胰岛素信号作用临界结节（critical nodes）。PI3K激活后通过提高磷脂酰肌醇三磷酸浓度激活下游分子Akt和蛋白激酶C (PKC)，促进葡萄糖摄取。

氢气是质量最小的气体分子，在许多动物包括人类的大肠内，细菌可以产生一定的氢气，这些氢气可以被机体摄取（14%）,然后经过循环和呼吸释放到体外。呼吸气体中检测氢气浓度可以用于某些疾病的诊断，例如小肠细菌过度增生、乳糖和果糖不耐受等。Gharib等曾经报道大量氢气通过抗氧化对抗寄生虫引起的肝脏损伤。Ohsawa等报道氢气具有选择性抗氧化作用，可以保护脑缺血再灌注损伤。随后有人分别报道氢气对各类缺血再灌注损伤、动脉硬化、胰腺炎、巴金森病和一型过敏反应具有治疗作用。现在已经有超过300篇相关报道。

尽管许多研究都分析了氢对糖尿病治疗的抗氧化作用，Although several studies have described the antioxidant effect of

但是很少有研究报道关于氢对糖尿病的其他作用（许多疾病的研究都存在类似的情况，这个研究启示我们可以对许多疾病开展更广泛更细致的研究）。这个研究中，作者首先用小鼠C2C12成肌细胞和人类肝癌Hep G2细胞，然后用STZ诱导、高脂饮食诱导和基因缺陷 db/db等三种糖尿病动物模型，体内外观察氢气在葡萄糖代谢的作用，并进行分子水平的分析。

研究方法

最重要的是关于不同浓度的氢溶液制备方法。他们选择三种不同的浓度，高浓度、低浓度和常规浓度。其中高浓度的饮水和生理盐水采用0.4 MPa处理24小时，氢浓度为0.8 mM；低浓度采用常压处理24小时，氢浓度为0.08 mM（请注意，根据我们的经验这个浓度可能不正确，或者水的深度太大，如果水的深度大，那么加压也无法达到0.8mM）；常规浓度0.075–0.125 mM的水由VANA Co., Ltd. (Yamanashi, Japan)公司每日提供。

High-content (saturated) H2 water and saline (HHW and HHS, respectively: 0.8 mM each) were prepared by dissolving H2 in pure water or saline under high pressure (0.4 MPa) for 24 hours. Lowcontent H2 water (LHW: 0.08 mM) was prepared by dissolving H2 in pure water under low pressure (0.1 MPa) for 24 hours. Artificial H2 water and saline were made every day. In this study, we also used natural H2 water (NHW) drawn from Mt. Fuji (Yamanashi, Japan). NHW containing 0.075–0.125 mM H2 was provided by VANA Co., Ltd. (Yamanashi, Japan) every day. LHW, HHW and NHW were placed in a glass vessel as drinking water for oral administration (p.o.). HHW and NHW were also used in vitro experiments. On the other hand, HHS was used for intraperitoneal (i.p.) injection. H2 content was measured with a hydrogen electrode (DH-35A, TOA DKK Co. Ltd., Tokyo, Japan).

比较不同类型的水对氢的保存

为了比较不同类型的水对氢的保存是否类似，他们对不同水放置不同时间的浓度进行了检测，其实这个影响因素非常多，和水的类型、深度和表面积关系最大，但他们并没有提供相关数据，只简单比较不同类型的水对氢的保存时间。这个问题值得商榷。

比较了氢和NAC和维生素C的抗氧化能力。

最核心的研究是分析了氢水对两种细胞葡萄糖摄取的影响，方法采用经典的2-DG方法，药物选择了三种，LY-2940002, a PI3K inhibitor (Sigma, St.Louis, MO, USA); chelerythrine, a PKC inhibitor (Sigma); and Compound C (6-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)-phenyl]-3-pyridin-4-

ylpyrazolo[1,5-a] pyrimidine), an AMPK inhibitor (Sigma)。这没有问题，本研究最大的问题是关于不同氢水对葡萄糖摄取影响的研究方法，作者将不同类型的氢水100ml纯水加入细胞，这样的水渗透压非常低，不太适合进行细胞学实验，更理想的方法应该用细胞培养基来制备含氢水。Glucose Uptake

Glucose uptake was determined by measuring the uptake of 2- [14C]-deoxy-D-glucose (2-DG) (323 mCi/mmol) (New England Nuclear, Boston, MA, USA) into C2C12 cells, as described previously [18]. In brief, the cells were washed with phosphatebuffered saline (PBS) containing 135 mmol/l NaCl, 2.7 mmol/l KCl, 8 mmol/l Na2HPO4, 1.4 mmol/l KH2PO4, 0.5 mmol/l MgCl2, 0.7 mmol/l CaCl2 and 22 mmol/l glucose. After incubation in serum-free and high-glucose (25 mmol/l) DMEM for 5 h, the cells were transferred to fresh incubation flasks with or without pharmacological inhibitors at the indicated concentrations for 30 min at 37uC. LY-2940002, a PI3K inhibitor (Sigma, St. Louis, MO, USA); chelerythrine, a PKC inhibitor (Sigma); and Compound C  (6-[4-(2-piperidin-1-ylethoxy)-phenyl]-3-pyridin-4- ylpyrazolo[1,5-a] pyrimidine), an AMPK inhibitor (Sigma), were used as pharmacological inhibitors. The cells were then incubated with 100 ml of pure water, HHW, degassed NHW or NHW at 37uC for another 30 or 60 min under continuous shaking at 40 cycles/min. Degassed NHW was prepared by shaking its container. Then, the cells were further incubated with 2-DG (1 mCi/ml) for 5 min at 37uC. Nonspecific uptake was obtained by parallel determinations in the presence of 20 mmol/l cytochalasin B (Sigma). Uptake was terminated by the addition of ice-cold PBS. After centrifugation, cells were washed twice with ice-cold PBS.

注射氢气盐水的实验是在STZ注射连续5天诱导后每天两次腹腔注射0.25ml氢气盐水连续4周，每周尾血检测血糖，最后动物处死用Western检测葡萄糖转运蛋白4含量。慢性实验，先确定模型成功后给动物饮三种不同浓度的氢水连续18周，高脂饮食模型连续25周给动物饮三种不同浓度的氢水。db/db 动物连续18周给动物饮三种不同浓度的氢水。动物每周尾血检测血糖，每30天一次葡萄糖耐量试验。血液胰岛素等指标采用常规方法检测。

研究结果

主要发现氢水对肌肉细胞葡萄糖摄取有促进作用，这一作用可以被多种信号分子阻断剂所逆转。动物实验发现，氢只对一型糖尿病有效果，但对慢性如高脂饮食和基因缺陷动物的糖尿病无效。

评语：总体上说，这个研究胆子比较大，关注的问题比较新，结论也有一定证据。但存在的问题仍比较突出，论文写作方面，前言比较好，值得参考。方法描述存在不少遗漏，例如比较关键的氢水处理细胞，作者没有给最终浓度或体积，没有考虑渗透压的影响。讨论方面，没有围绕主要结果讨论，许多话都没有什么价值，无法体现出作用主要发现什么，主要希望解决了问题等重要议题。研究主要发现氢对急性有效，对慢性糖尿病无效的原因他们认为可能是剂量问题，这似乎有一些牵强，不过从氢对葡萄糖摄取的影响看，如果对急性有效，对慢性无效似乎难以理解。在细胞学实验中本质是快速效应，无法和在体数周的研究对应，无论功能指标和蛋白的变化都不是一个层次的改变。因此这个研究存在许多问题值得推敲。