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[转载]改造农杆菌，提高植物转基因效率！
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Agrobacterium expressing a type III secretion system delivers Pseudomonas effect.pdf
撰文 | LX
责编 | 奕樊
在生物学研究中，根癌农杆菌是获得转基因植物的一种重要工具，它本身是一种土生的病原菌，可以侵染植物形成冠瘿瘤。在侵染植物过程中，根癌农杆菌利用自身的四型分泌系统T4SS将T-DNA及毒蛋白从细菌体内转移到宿主细胞【1】，毒蛋白进一步帮助T-DNA整合到植物基因组。T-DNA上的促进生长素及细胞分裂素合成的基因的表达促进植物感病部位异常生长，形成冠瘿瘤，为农杆菌的生长提供了营养【2】。正是利用这种特性，农杆菌被广泛应用于产生转基因植物的基础研究和商业育种过程。然而，还有很多植物对于农杆菌的侵染不敏感，限制了相关应用。侵染失败的主要原因在于农杆菌激发了植物内源的免疫防御反应，抑制了农杆菌的生长。病原菌的侵染首先触发的是植物PTI免疫系统【3】，在PTI防御反应中，植物通过细胞膜定位的模式识别受体（PRRs）识别病原菌的病原相关分子模式（PAMPs），触发下游的防御反应，抑制病原菌的生长。不同于根癌农杆菌的T4SS分泌系统，许多的革兰氏阴性细菌如丁香假单胞菌的分泌系统为三型（T3SS）【4】，T3SS为针状结构，可以穿过细菌的内外细胞膜和植物的细胞膜、细胞壁。利用T3SS，丁香假单胞菌能够将三型效应因子T3Es包括AvrPto、AvrPtoB、HopAO1等运送到植物体内，这些T3Es可阻断植物PTI反应，帮助细菌在宿主内的生长繁殖【5】。
近日，来自美国诺贝研究所的Kirankumar S. Mysore团队发现T3SS编码基因可在农杆菌中正常的表达，并且可用于向植物细胞内传递T3Es或者植物蛋白H2A-1，从而提高农杆菌介导的植物遗传转化效率。相关结果以Agrobacterium expressing a type III secretion system delivers Pseudomonas effectors into plant cells to enhance transformation为题发表于杂志NATURE COMMUNICATIONS上。
研究者首先证明来源于丁香假单胞菌的分泌系统T3SS编码基因可在根癌农杆菌中正常表达，农杆菌中组装的T3SS可将T3E效应因子AvrPto分泌到培养基中。利用同时表达T3SS和AvrPto的农杆菌侵染烟草叶片时，能在烟草表皮细胞细胞膜上检测到AvrPto。这些结果表明根癌农杆菌既可以利用自身的T4SS分泌系统转运蛋白质和T-DNA，也可以利用异源T3SS分泌系统转运相关蛋白质。
同时表达T3SS和AvrPto显著提高了农杆菌的瞬时侵染能力，促进被侵染的拟南芥根部肿瘤及抗性愈伤组织的产生，并使拟南芥沾花法的转化效率提高了两倍（图1），使用其他T3E效应因子，如AvrPtoB、HopAO1，也得到了同样的结果。类似的实验结果在烟草以及小麦、紫花苜蓿、柳枝稷等作物中得到验证。
图1：表达T3SS和AvrPto的根癌农杆菌可显著提高拟南芥的转基因效率
T-DNA从农杆菌到宿主基因组的整合过程需要农杆菌毒蛋白的协助，T3SS和T3E的表达对于农杆菌virA、virB2、virD2、virE3等毒基因的表达没有明显影响，却可以显著下调植物PTI反应的标记基因FRK1和NHL10的表达。说明T3SS和T3E是通过抑制植物PTI防御反应，而不是激活毒基因表达来提高农杆菌的侵染能力。
前人研究表明，过表达组蛋白H2A-1全长或者截短蛋白tHTA1（仅包含H2A-1的前39个氨基酸）可以提高植物的转化效率[6]。研究者对根癌农杆菌进行改造，使其同时表达T3SS和H2A-1，或T3SS和tH2A-1。改造后的菌株同样也可以显著提高拟南芥、烟草、紫花苜蓿、柳枝稷的遗传转化效率。
综上所述，本研究利用T3SS分泌系统对根癌农杆菌进行改造，使用改造后的菌株向植物细胞内输送效应因子T3Es或者植物蛋白H2A-1，显著提高了植物的遗传转化效率。研究结果对于克服植物的遗传转化瓶颈具有重要意义，同时本研究也建立起了一种不依赖转基因的向植物细胞投递目的蛋白的有效方式。
参考文献：
[1] Guo, M., Ye, J., Gao, D., Xu, N. & Yang, J. Agrobacterium-mediated horizontal gene transfer: mechanism, biotechnological application, potential risk and forestalling strategy. Biotechnol. Adv. 37, 259–270 (2019).
[2] Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E. & Yuan, Z.-C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. https://doi.org/10.3389/fpls.2014.00322 (2014).
[3] Macho, A. P. & Zipfel, C. Plant PRRs and the activation of innate immune signaling. Mol. Cell 54, 263–272 (2014)
[4] Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim. Bophys. Acta 1694, 219–234 (2004)
[5] Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4, 811–825 (2006).
[6] Mysore, K. S., Nam, J. & Gelvin, S. B. An Arabidopsis histone H2A mutant is deficient in Agrobacterium T-DNA integration. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 948–953 (2000).
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