常用的细胞活力检测试剂主要有 MTT、CCK8 等检测方法 (图 1)。
MTT法:又称 MTT 比色法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan) 并沉积在细胞中,但死细胞无此功能,后经 DMSO 溶解,于 490 nm 处测定吸光值便可间接反应细胞活力。但该方法除去操作步骤耗时以外,生成的 Formazan 是不溶于水的,需经 DMSO 溶解后才能检测,增加了工作量的同时仍不能保证测定结果的准确性,且该溶剂对人体具有明显毒性。
CCK8法:相较于 MTT,无论是操作步骤还是检测时间都优化了很多。CCK8 是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测方法(可看往期推文 CCK-8,让细胞活性检测 So Easy!)。但在实验时,一直有个问题让人很困扰——“细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅”,但这个颜色深浅的标准我 “标” 不出来怎么办?痛点!痛点!痛点!
科研汪 :MTT 作为“元老”级别的检测方法,虽然“老练”,Paper 无数,但麻烦是真麻烦,CCK8 法倒是便捷很多!
小 M:CTG 细胞活力检测,简单、灵敏、快速的均质检测方法,反应 10 分钟即可得到“Bling Bling”的检测结果,你就说“快不快”?
CTG 发光法:基于高灵敏度生物发光检测技术,通过对三磷酸腺苷 (ATP) 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。该实验方法可用三个字简单概括 “快、准、狠”,比 MTT 的处理速度快近 20 倍,节省时间近 4 小时。CTG 特有的均质检测法即 “加样-混样-检测”,使用时,只需将本试剂等体积添加至培养细胞中即可进行检测。不用感慨,细胞活力检测为什么不能如此简单?
图 1. MTT、CCK8 与 CTG 法的实验流程图
■ 案例 1:细胞增殖测定
CCK-8 检测:TNBC 细胞瞬时转染 shRNA 或过表达质粒并培养 24 h 后检测。
CTG 发光细胞活力测定:TNBC 细胞在 37°C 下培养过夜。然后,将 100 µL CTG 溶液直接与培养基混合,在室温下培养 20 分钟。结果显示,转染靶向 SIPL1 shRNAs 的 BT-549 和 MDA-MB-231 细胞系的细胞增殖显著降低 (图 3)。
图 3. SIPL1 对 TNBC 细胞活力的影响[1]
CCK-8 (a) 和 CTG 发光细胞活力测定 (b) 用指示载体转导 BT-549 和
MDA-MB-231 细胞增殖能力的分析。
如图 4 所示,为了探究外源 RRM2 是否会影响肝癌细胞的铁死亡,在 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中过表达或敲除 RRM2,通过 CTG 法检测其对细胞活力的影响。结果表明,过表达 RRM2 时,细胞活力明显增强,反之,敲除 RRM2 时,细胞活力明显降低[1]。
图 4. 通过 CTG 法测定 RRM2 对细胞活力的影响[2]
(a) 在体外表达或敲除 RRM2 的 HepG2 和 SMMC-7721 细胞中测量细胞死亡 (b) 和 4-HNE 水平 (c),然后再用 Fer-1、ZVAD-FMK、Nec-1 或体外表达的 RRM2 进行进一步处理。细胞活力测定采用 CTG 发光细胞活力测定法。
如下图所示,作者团队报告了一种基于浓度-反应曲线的表型定量高通量筛选 (qHTS),旨在识别对疟原虫肝脏和无性血期寄生虫具有活性的化合物 (图 5)。使用 SYBR Green 或荧光素酶来测试对寄生虫生长的抑制,共检测了 456,817 种化合物。
在 qHTS 之后,又分类选择了 4,253 种合成易处理的化合物,用于验证抗疟原虫活性和哺乳动物毒性。在 3 μM 和 1 μM 浓度下对化合物进行体外抗伯氏疟原虫肝期寄生虫的评估。其中使用 CTG 法评估了所有 4,253 种化合物对 HepG2 的细胞毒性。其中 255 种化合物对 HepG2 细胞表现出一定程度的生长细胞毒性,AC50 值 < 43 µM (随后被排除)。最终筛选出 994 种经过验证的无毒性化合物,用于针对肝阶段寄生虫的后续评估。
图 5. 针对恶性疟原虫无性血期寄生虫的定量高通量筛选[3]。
对比测试结果表明:持续 3 h 的生物发光稳定性的检测中,MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 的发光信号值比较稳定 (图 5a);不同细胞数的线性范围中,MCE 产品线性关系良好,与进口 竞品线性几乎一致 (图 5b);且对于不同细胞系,MCE 产品与进口竞品检测信号值相当 (图 5c)。综上检测结果表明,MCE CTG 试剂盒可实现稳定、灵敏、批次间差异较小的不同细胞系的细胞活力检测。
表 2. MCE CTG Cell Viability Detection Reagent 产品特性
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实验小 Tips,附上 CTG 使用注意事项,希望你能早日发 SCI 啦。
相关产品 Cell Counting Kit-8,简称 CCK-8 试剂盒或 CCK8 试剂盒,是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞活性和细胞毒性检测的快速、高灵敏度试剂盒。 CTG Cell Viability Detection Reagent MCE CTG 发光法细胞活力检测试剂盒基于高灵敏度生物发光检测技术,通过对 ATP 进行定量以测定培养物中活细胞数目及细胞活力。 MCE LDH Assay Kit 是通过分析释放到培养上清液中的 LDH 活性而测定细胞损伤的试剂盒。配合使用 CCK-8 (Cat.: No. HY-K0301) 可获得死细胞、活细胞数据。 参考文献
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