仇伟伟
H2DCFDA | ROS 荧光探针检测法 - MedChemExpress
2022-5-26 22:38
阅读:606
H2D CF DA 工作液的配制

1、储存液的配制:用 DMSO 配制 10 mM 的 H2DCFDA (2,000×),如用 1.03 mL DMSO 溶解 5 mg H2DCFDA。

注:H2DCFDA 储存液建议分装后-20℃ 避光冻存,一个月。-80 半年。


2工作液的配制:用预热好的无血清细胞培养基或缓冲液 (如 PBS) 稀释储存液,配制终浓度为 5-10 μM 的 H2DCFDA 工作液 (1×)。
注:H2DCFDA 工作液建议现用现配,具体浓度可根据实际情况调整。


细胞染色
悬浮细胞

a) 以 6 孔板为例,接种适量数目的细胞,37℃,培养过夜。

b) 细胞密度达到 80%-90% 后,进行染色处理或阳性/阴性对照处理 (选做)。

c) 阴性对照(选做): 用预热的 1 mL PBS 清洗细胞 2-3 次后,用新鲜制备的 5 mM NAC 37℃ 处理 1 小时(或 0.1 mM H2O2 作为阴性对照37℃ 处理 20-30 分钟)。

d) 去除培养细胞的培养基直至无残留,每孔添加 1 mL 1×H2DCFDA 工作液,37℃ 细胞培养箱内孵育 30 分钟。

e) 400 g,4℃ 离心 3-4 分钟,沉淀细胞。弃上清,注意尽量不要吸除细胞。

f) PBS 再次清洗细胞,以充分去除未进入细胞内的 H2DCFDA

g) 加入 1 mL 无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞,用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察,也可以用荧光酶标仪或流式细胞仪分析 (Ex/Em=488/525 nm)。

图 1. 悬浮与贴壁细胞染色流程图 (有对照)。


贴壁细胞

注:若用荧光分光光度计或流式细胞仪检测贴壁细胞,可先对贴壁细胞进行消化、收集,重悬后参考悬浮细胞的检测方法。



哺乳细胞染色:以 Photodynamic therapy induces autophagy-mediated cell death in human colorectal cancer cells via activation of the ROS/JNK signaling pathway 一文中探针使用为例,研究者先使用 m-THPCVerteporfin 处理 HCT116 细胞,然后使用 H2DCFDA 染色,并通过流式细胞术测量 ROS 的产生。如图所示,HCT116 细胞中 ROS 的产生以时间依赖性方式增加。


图 2. HTC116 细胞用 0.35 μM Verteporfin 处理,流式细胞术检测 ROS 水平[1]


植物细胞染色:以 FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa 一文为例,在这篇文章中,为了证明 ROS 产生是否参与十字花科植物的自交不亲和反应,对未授粉 (UP),自花授粉(SI),亲和授粉(CP) 的柱头,进行了 ROS 染色。

结果表明,与未授粉 (UP) 柱头的稳态 ROS 水平相比,自花授粉后 1 min ROS开始显著增加,30 min 内达到最大值 (图 2A)。用 H2DCFDA 和 细胞壁指示剂 PI 共染色柱头,ROS 位于乳头细胞的细胞质中,靠近质膜外围(图 1C)。上述结果表明,自花花粉在大白菜的柱头乳头细胞中触发了高水平的活性氧 (ROS),可能参与自交不亲和 (SI) 的发生。

图 3. 的ROS染色与质膜完整性共成像[2]
a. 十字花科植物柱头的 ROS染色 b. 共成像
除了上述柱头染色, 还可用于原生质体染色,如图 4 所示,用 H2DCFDA 对原生质体进行染色以检测 ROS 的产生,并通过活细胞成像 (Live-cell imaging) 跟踪整个过程。结果表明,原生质体中的 ROS 水平持续升高。
注:微生物、植物叶片、原生质体、花柱头等的 H2DCFDA 染色浓度及孵育时间,需根据具体植物样本调整。


图 4. 原生质体中 ROS 积累检测[3]

HKPerox-2H2O2 作为一种稳定的活性氧成分,在氧化损伤和细胞信号转导中也是发挥着很重要作用的。下面图 5a 就可以看出对 H2O2 的高选择性。此外,用 H2O2 处理细胞,HKPerox-2 的荧光 30 分钟内就可以到达巅峰。染色效果看图5c,亮眼的绿色荧光。使用方法和 H2DCFDA 的差不多。

图5. HKPerox-2 用于 H2O2 检测

a. HKPerox-2 对 H2O2 的选择性 b. HKPerox-2 荧光强度 c. HKPerox-2 细胞染色效果


HKSOX-1、 HKOH-1r:分别是超氧阴离子自由基 (O2•−)和羟基自由基 (OH) 荧光探针。动物细胞操作同上,使用浓度、孵育时间如有雷同纯属巧合。


相关产品

H2DCFDA

用于检测细胞内活性氧(ROS) 的探针。

HKSOX-1

对超氧阴离子自由基具有极好的选择性和敏感性。可用于成像和检测活细胞的内源性超氧化物。

HKPerox-2

对H2O2 有高度选择性,绿色荧光探针。

HKOH-1r

用于检测活细胞中的内源性羟基自由基•OH。

MCE的所有产品仅用作科学研究或药证申报,我们不为任何个人用途提供产品和服务


参考文献

1. Changfeng Song, Wen Xu, Hongkun Wu, Xiaotong Wang et al. Photodynamic therapy induces autophagy-mediated cell death in human colorectal cancer cells via activation of the ROS/JNK signaling pathway. Cell Death Dis. 2020 Oct 31;11(10):938.

2. Jijie Chai, Kangmin He, Yu-Hang Chen, Jian-Min Zhou, et al. The ZAR1 resistosome is a calcium-permeable channel triggering plant immune signaling. Cell. 2021 Jun 24;184(13):3528-3541.e12.

3. Lili Zhang 1, Jiabao Huang 2, Shiqi Su 1, Xiaochun Wei 3, Lin Yang 1, Huanhuan Zhao 1, Jianqiang Yu, et al. FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa. Curr Biol. 2021 Jul 26;31(14):3004-3016.e4


转载本文请联系原作者获取授权,同时请注明本文来自仇伟伟科学网博客。

链接地址:https://wap.sciencenet.cn/blog-3506747-1340355.html?mobile=1

收藏

分享到:

当前推荐数:0
推荐到博客首页
网友评论0 条评论
确定删除指定的回复吗?
确定删除本博文吗?