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Flow Jo软件分析细胞周期样品
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FlowJo分析细胞周期样品
作者：胡金涛
细胞周期的检测是流式细胞仪最为广泛的应用之一。细胞周期是指以有丝分裂方式增殖的细胞从亲代分裂结束到子细胞分裂结束所经历的过程。通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。
细胞周期检测的原理：
核酸染料可以与DNA分子特异性的结合，细胞周期检测中PI最为常用。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
细胞周期示意图如（图一）所示
（图一）
FlowJo分析细胞周期数据的过程
1. 把细胞周期样品拖入FlowJo软件，双击打开原始数据。如(图二)所示：
(图二)
X轴选择FSC,Y轴选择SSC。分析细胞周期的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。
2. 在SSC/FSC图中双击分析的细胞群体，如（图三）所示：
（图三）
X轴选择FL3-LIN,用来表示PI的线性信号。Y轴选择FL3-PEAK,用来表示PI的峰值信号。本实验数据采集采用的是贝克曼仪器采集的数据。（如果是BD的仪器采集的数据，X轴选择FL2-W,用来表示PI的宽度信号。Y轴选择FL2-A,用来表示PI的面积信号），如上图所示多倍体或异倍体细胞不予分析。
3. 在FlowJo工作台中选中“用于周期分析的二倍体细胞”这个结点，在工具栏的“工具”中选择“细胞周期”。
如（图四）所示
（图四）
说明：
1) 分析的模型有Watson和DJF两种，用户可以选择任意一种进行分析，两模型间没有实质的差别。模式右边是两种模型的显示方式。
2) 细胞周期拟合原则：G1峰限制和G2峰限制。根据实验结果拟合情况，对G1峰限制和G2峰限制进行适当的调整。
- 曲线调整原则：粉色的曲线为模型曲线，黑色的为样本曲线，理想状况是粉色和黑色曲线吻合一致为最佳。拟和的好坏可以根据右边的RMS值来判断。RMS(root mean square)值越小越好。但是这只是一个相对值，只在同样本不同模拟情况下，选取最小值来达到最佳拟和。你可以选中G1期的峰或G2期的峰，根据调节按钮调节峰的宽度
- 通常来说，G2的位置为G1的2倍。 你可以根据相对固定的那个峰来确定另外一个峰的位置，如G1峰相对固定的话，就选择G2峰的均数为G1的2倍(2G1)；如果G2峰相对固定的话，就选择G1峰为G2峰的0.5G2
细胞周期结果分析：
4. 图三中各个区域的含义：
- G1期含义：细胞进行大量物质合成时期，为DNA合成做准备。
- S期含义：开始至完成DNA的合成以及合成组蛋白。
- G2/M期的含义：DNA复制结束和开始有丝分裂之间的间隙。
- 通常，根据G1期、S期、G2期的百分含量来判断细胞周期的变化。相对于正常的细胞，加药或者照射的细胞的周期可能会发生变。一般根据S+G2期的百分含量判断处理后的细胞是促进增殖还是抑制增殖。
5. 细胞周期分析常用术语：
- CV：变异系数。不同细胞群体DNA含量的细微差别可能有生物学上的重要意义，因此DNA含量的流式分析中分辨率尤其关键。通常检测分辨率或精度由G0/G1峰的CV来反映。影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素和样品制备及染色过程对标本的人为影响。
- Ploidy:倍体。原指染色体数目。流式中用来描述总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA 含量但不排除染色体的异常。
- S期含量 :S期细胞占总细胞周期的比例。
细胞周期数据结果输出
6. 细胞周期结果的输出根据最终的需求可以有多种输出方式
- 在细胞周期分析窗口工具栏中选择“文件”并单击，选择下拉菜单中的“另存为”，选择保存位置、重新命名文件名以及文件保存的文件类型（SVG、PNG、EMF、JPG）。
- 把上述样品的分析应用到组中，在Flow Jo软件界面中单击打开布局编辑器，在工作台的样品空间把“分析的细胞群体结点”拖入布局编辑器中，单击布局编辑器右上角的Batch工具。输出整个实验组的数据。如（图五）所示
（图五）
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