撰文| 胡敏 马莹 武霞 张俊 陈江榕 郭明伟 

编辑| 孟美瑶 

校对| 张俊

背景介绍

多囊卵巢综合症（PCOS）是一种复杂的生殖代谢疾病，也是影响育龄妇女最常见的内分泌疾病之一，发病率为10%至13%。多囊卵巢综合症的临床症状多种多样，包括高雄激素血症、少排卵或无排卵、多囊卵巢以及许多情况下的代谢紊乱。多囊卵巢综合症众多表型如卵泡发育不良、排卵障碍、子宫内膜疾病和代谢功能障碍主要是雄激素过多引起的。此外，产前雄激素过多会诱导女性后代出现类似多囊卵巢综合症的特征，从而增加多囊卵巢综合症的遗传易感性。因此，控制雄激素过量对多囊卵巢综合症的干预至关重要。

女性的雄性激素主要由肾上腺和卵巢合成。胆固醇经过细胞色素 P450（CYP）和羟类固醇脱氢酶（HSD）催化的一系列酶促反应会形成雄激素，CYP 家族11亚家族A成员1（CYP11A1）、CYP17A1、HSD3B2和HSD17B参与了这个过程。在卵巢内，雄烯二酮和睾酮主要在卵泡膜细胞中合成，然后扩散到颗粒细胞，在那里通过芳香化酶（CYP19A1）转化为雌激素（小编注：CYP19A1表达下降也可能与PCOS的发展有关。多项研究表明，PCOS患者的颗粒细胞中CYP19A1基因的mRNA表达水平较非PCOS患者低。CYP19A1表达的下降导致芳香化酶活性降低，这可能导致睾酮水平上升，进而促成PCOS患者常见的高雄激素血症特征）。促卵巢类固醇的生成（如黄体生成素（LH）或人绒毛膜促性腺激素（hCG））高度响应雄激素刺激。大量研究表明，在多囊卵巢综合征患者的卵泡膜细胞中，CYP11A1和CYP17A1的表达增加，CYP17A1、HSD3B和HSD17B的酶活性升高，导致孕酮、17α-羟孕酮（17α-OHP）和睾酮的生成增加。因此，抑制这些类固醇生成相关酶的过度表达可有效控制高雄激素血症和多囊卵巢综合症。

性激素合成

性激素是指由动物的性腺，以及胎盘、肾上腺皮质等合成的甾体激素。性激素包括雄激素、雌激素和孕激素。它们是由胆固醇衍变而来，因此又称为类固醇激素或甾体激素。

雄激素主要分为四类，即二氢睾酮（DHT）、脱氢表雄酮（DHEA）、雄烯二酮（A4）、睾酮（T），其中T是具有真正生物活性的雄激素，其他各类雄激素是T合成过程中的中间代谢物和前体形式；雌激素主要包括雌二醇（E2），雌酮（E1）和雌三醇（E3）；孕激素主要包括孕酮、20α-羟孕酮、17α-羟孕酮，其中孕酮的生物活性最强。

在两性中，雄激素的合成主要通过两种合成途径：

一、经典的合成途径

1. Δ5途径：

（1）胆固醇的转移和孕烯醇酮的形成：促肾上腺激素诱导生成急性调节蛋白StAR的表达和活化，StAR协调胆固醇向线粒体内膜转移，被认为是雄激素合成的限速步骤，随后，在CYP11A1的催化下，胆固醇转化为孕烯醇酮（pregnenolone）。

（2）孕烯醇酮转化为脱氢表雄酮（DHEA）：孕烯醇酮向DHEA的转化分为两个步骤，由细胞色素P45017A1（CYP17A1）催化，首先CYP17A1在孕烯醇酮17位羟化孕烯醇酮，将其转化为17-α羟基孕烯醇酮（17OHP5），然后断裂其C17和C20之间的碳键，将其转化为DHEA。

（3）雄烯二酮（A4）和睾酮（T）的生成：DHEA在HSD3B2编码的Ⅱ型3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）作用下被转化为A4，也可以在AKR1C3编码的Ⅴ型17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）的催化下转化为雄甾烷二醇（androstenediol），随后在3β-HSD的作用下转化为T，T和A4在17β-HSD的作用下可以互相转换。

2. Δ4途径：

Δ4途径与Δ5途径的不同之处在于孕烯醇酮形成之后会生成孕酮，随后，CYP17A1催化孕酮形成17-α羟孕酮（17OPH4），来自Δ5途径的17OPH5也可以在3β-HSD的催化下转化为17OPH4，Δ4的产物并直接不合成T，而是在后门合成途径被激活后生成DHT。

二、后门合成途径

在该合成途径中，来自Δ4途径的17OPH4或孕酮（PROG/P4）作为5-α还原酶（SRD5A1）的底物进入后门合成途径，用于合成DHT。SRD5A1将17OPH4转化为17α-羟基二氢孕酮（17OH-DHP），3α羟基类固醇脱氢酶（AKR1C2/4）将17OH-DHP转化为17α-羟基异孕酮（17OH-ALLO），这一代谢物随后被CYP17A1转化为雄酮（androsterone），雄酮在AKR1C3的催化下进一步被转化为雄甾烷二醇（androstenediol），随后，AKR1C2/4或类视黄醇脱氢酶（RoDH）将雄甾烷二醇转化为二氢睾酮（DHT）。在正常情况下，经典的合成途径是雄性睾丸中合成雄激素的主要途径，后门合成途径在男性胎儿的性分化过程中发挥重要作用，在某些特定的病理条件下其活性较高，如肾上腺皮质功能亢进、先天性肾上腺增生等。

在合成部位上，在雄性中，雄激素主要在睾丸的间质细胞Leydig细胞中合成，雌性中雄激素的合成场所主要是卵泡膜细胞和肾上腺皮质。

在雌性中，肾上腺皮质和卵巢合成的雄激素在卵巢颗粒细胞和脂肪组织中被转化为雌激素，转化过程主要包括以下几个步骤：胆固醇首先被转化为孕烯醇酮，然后通过一系列酶促反应，包括CYP11A1和HSD3B2的作用，转化为雄激素前体物质，如A4。A4和T分别在芳香化酶（CYP19A1）的作用下被转化为E1和E2。此外，由于女性绝经后卵巢功能显著衰退，所以脂肪组织成为雌激素合成的主要场所。

在合成调控上，雄性中雄激素合成受到促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing-hormone，GnRH）和T调控，进而促进Leydig细胞合成分泌雄激素。雌性中性激素合成受到促性腺激素的调控，包括促黄体生成素（luteinizing hormone，LH），促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）和绒毛膜促性腺激素（chorionic gonadotropin，CG），这些激素由垂体前叶细胞分泌，受到GnRH的调控，LH和FSH能促进排卵，刺激卵巢分泌性激素和孕酮，CG水平主要在孕早期升高，促进孕酮的合成和分泌，二者共同维持子宫内膜的生理变化。

参考文献

[1] Wickenheisser JK, et al. Trends Endocrinol Metab. 2006 Mar;17(2):65-71.

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[4] O'Shaughnessy PJ, et al. PLoS Biol. 2019 Feb 14.

目前，针对多囊卵巢综合症的药物干预主要是针对特定症状的治疗。很少有药物能有效针对多囊卵巢综合症的所有症状。医生建议使用复方口服避孕药（Combined oral contraceptives，COCs）来控制患有多囊卵巢综合症成年女性的高雄激素和/或月经周期不规律。然而，COCs 并不能改善不孕症和多囊卵巢的形态。此外，COCs 常常伴有副作用，如血管血栓栓塞，这限制了其长期临床应用。青蒿素是从青蒿植物中分离出来的一种分子，具有抗疟作用。研究人员以前曾证实，青蒿素及其衍生物，包括蒿甲醚（ATM）、青蒿琥酯（ATS）和 SM934，可通过激活产热脂肪细胞促进能量消耗和胰岛素敏感性，从而预防高脂饮食引起的肥胖和代谢紊乱（小编注：该文发现ATM促进了脂肪细胞的棕色化基因的表达水平（如PRDM16、UCP1和PGC1a），降低了小鼠脂肪组织重量，减少HFD条件下小鼠脂肪面积，改善小鼠的GTT和ITT。机制上，ATM激活p38 MAPK/ATF2轴，抑制Akt-mTOR信号通路来促进产热预防肥胖）在本文中，研究人员将青蒿素类药物确定为治疗多囊卵巢综合征有希望的候选药物，因为它们能强烈抑制多囊卵巢综合征啮齿类动物模型和女性患者的卵巢雄激素合成、减少未成熟卵泡并改善发情周期。

复方口服避孕药治疗多囊卵巢综合征的机制

COSs治疗PCOS的作用机制主要包括三个方面

1.抑制排卵：在PCOS患者体内黄体生成素LH水平异常，使得LH对卵泡膜细胞的刺激增加，进而卵泡刺激素FSH的水平上升，导致雄激素分泌过多，导致卵泡发育异常。COCs通过抑制下丘脑-垂体-卵巢轴来降低促性腺激素释放激素（GnRH）的频率，从而减少黄体生成素LH和卵泡刺激素（FSH）的分泌，从而减少未成熟卵泡的产生。

2.降低雄激素水平：在正常患者血液中，大多数雄激素与性激素蛋白结合球蛋白（SHBG）结合，极少部分的性激素呈游离状态，具有生物活性，在PCOS患者血清中游离的雄激素水平升高，SHBG的水平在患者体内也下调，COCs会与游离雄激素结合，降低血清中的游离雄激素水平，从而减轻高雄激素症状。

3.抗雄激素作用：COCs中含有抗雄激素活性的孕激素，这些成分可以抑制卵巢和肾上腺产生的雄激素，缓解高雄激素血症。

COCs 常常伴有副作用，如血管血栓栓塞。COCs促进血栓栓塞的原因主要有：（1）COCs会增加患者血液中的凝血因子，使血液成高凝状态；（2）COCs直接作用于静脉，使血液缓慢或停滞；（3）降低某些血凝抑制剂，如抗凝血酶Ⅲ；（4）改变血小板的功能

敲黑板啦！

1. 青蒿素类似物降低PCOS小鼠模型和患者中CYP11A1水平；

2. LONP1促进CYP11A1水解，减少雄激素合成；

3. 青蒿素与LONP1抑制剂竞争结合LONP1，从而水解CYP11A1。

研究结果

1 在啮齿动物模型中，ATM对多囊卵巢综合症样表型具有抑制作用

为了评估青蒿素类药物对多囊卵巢综合症发病进程的影响，研究人员使用脱氢表雄酮（DHEA）（小编注：这是最丰富的类固醇激素之一，可以转化为雄激素）建立了PCOS小鼠模型，并同时用一种青蒿素类药物 ATM 对小鼠进行治疗（图1，A和B）。将DHEA和ATM同时给药时，ATM可消除DHEA引起的小鼠血清中升高的睾酮，从而防止多囊卵巢综合症样特征（图1C）。ATM还能改善DHEA引起的发情周期紊乱（图1D）。PCOS小鼠的卵巢表现出囊样卵泡和前卵泡数量增加，排卵后黄体减少，而ATM处理的小鼠卵巢表现出正常形态，卵泡处于不同的发育阶段（图1E）。代谢监测结果表明，ATM对体重、脂肪量、瘦肉量、肝脂肪变性和葡萄糖耐量没有影响（图 S1，A至D）。ATM对DHEA处理小鼠胰岛素敏感性有改善趋势（图S1E），这是缓解多囊卵巢综合征的指标之一。尽管DHEA本身没有显示出对血清甘油三酯（TG）水平的明显影响，但ATM 降低了DHEA诱导的小鼠的血清甘油三酯（TG）（图 S1F），但对总胆固醇（TC）和葡萄糖水平没有影响（图 S1，G 和 H）。此外，ATM处理后的小鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）水平不变，表明它没有肝毒性（图 S1I）。

在观察到预防效果的基础上，研究人员评估了ATM的治疗效果。在建立了DHEA诱导的PCOS模型后，研究人员对小鼠腹腔注射不同剂量的ATM对小鼠进行治疗（图 1F）。结果表明，ATM剂量依赖性地降低了血清睾酮水平（图1G），恢复了小鼠正常的发情周期（图1H），抑制了子宫水肿（图1I），并显著减少了卵巢中的囊性卵泡（图1J）。小鼠在口服 ATM 后也观察到了类似的治疗效果（图 1，K至O）。

接下来，研究人员在大鼠模型中研究了ATM的抗多囊卵巢综合症作用（图 2A）。腹腔注射15mg/kg ATM 足以将 PCOS大鼠的血清睾酮降至与对照大鼠相似的水平（图 2B），并缓解发情周期紊乱（图 2C）。卵巢组织学分析表明，ATM逆转了经DHEA处理大鼠的少排卵表型，表现为排卵后黄体的升高和囊状卵泡的减少（图 2D）。同样，口服ATM也抑制了大鼠模型中多囊卵巢综合症的类似表现（图S2，A至C）。

这些发现在另一种通过注射胰岛素和 hCG （人绒毛促性腺激素）（这两种药物都是雄激素分泌的强烈诱导剂）建立的PCOS大鼠模型中得到了进一步验证（图 2E）（小编注：胰岛素抵抗是PCOS的一个特征，这种状态下，身体为了补偿胰岛素抵抗而分泌更多的胰岛素，导致高胰岛素血症。高水平的胰岛素可以刺激卵巢中的卵泡膜细胞分泌雄激素。此外，胰岛素也能够增强促性腺激素（如黄体生成素LH）对卵巢的刺激作用，进一步促进雄激素的产生。hCG在结构上与LH相似，并且可以与LH受体结合，模拟LH的作用。因此，hCG能够刺激卵巢中的卵泡膜细胞和胎盘的滋养层细胞分泌雄激素。在怀孕期间，hCG的水平显著升高，有助于维持黄体的功能，黄体则负责分泌维持妊娠所需的孕激素和雌激素。然而，hCG对雄激素分泌的直接影响在正常妊娠中并不是主要的生理作用。通常情况下，妊娠期并不被视为高雄激素状态。虽然hCG在妊娠早期迅速上升，并具有类似LH的生物活性，但其主要作用是维持黄体功能，确保妊娠的继续进行。妊娠期间的雄激素水平可能会有所变化，但通常不会达到高雄激素状态）。ATM 治疗可明显（P = 0.0026）降低 PCOS大鼠的血清睾酮含量（图 2F），使发情周期完全恢复正常（图 2G），并能够抑制多囊卵巢形态，增加排卵后黄体的生成（图 2H）。生育能力测试表明，ATM显著提高了 PCOS大鼠的胚胎着床率（图 2I），并显著（P = 0.0039）提高了产仔数（图 2J）。总之，ATM治疗啮齿动物模型改善了PCOS的主要特征，包括血清睾酮升高、发情周期不规律、多囊卵巢形态和低生育力。

图 1| 在小鼠模型中鉴定ATM作为抗PCOS的药物

图 2| 在大鼠模型中，ATM可逆转PCOS表型

图 S1| ATM治疗的PCOS小鼠模型的代谢表型

图 S2| 在大鼠模型中，ATM缓解PCOS的表型

2 青蒿素抑制卵巢中的类固醇生成和睾酮分泌

ATM导致睾酮急剧减少，这促使研究人员探索青蒿素在调节雄激素合成方面的作用。下丘脑-垂体-卵巢轴在雄激素生成中发挥着关键的神经内分泌作用（小编注：肾上腺也是女性雄激素的一个来源，其调控机制与卵巢相似。下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO轴）涉及下丘脑释放促性腺激素释放激素（GnRH），进而刺激垂体前叶分泌促性腺激素，包括黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）。这些激素作用于卵巢，促使其合成和分泌雄激素，尤其是雄烯二酮。而肾上腺的雄激素生成受到垂体分泌的ACTH（肾上腺皮质激素）的调控，而ACTH的分泌又受到下丘脑分泌的CRH（促肾上腺皮质激素释放激素）的影响。这构成了下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）。除此之外，肾上腺的雄激素合成还受到自主神经系统的影响，尤其是交感神经系统，它可以调节肾上腺的酶活性，从而影响雄激素的合成）。因此，研究人员首先测定了促卵泡刺激素（FSH）和促黄体素（LH）（小编注：促卵泡刺激素（FSH）和促黄体生成素（LH）在雄性和雌性中都存在，并且在两性中都发挥着重要的生理作用。在女性中，FSH促进卵巢中卵泡的成熟和发育，刺激颗粒细胞增殖，增加雌激素的产生。LH触发排卵，促进黄体的形成和维持，刺激黄体分泌孕激素和雌激素。在男性中，FSH虽然还叫卵泡刺激素，但也称为“精子生成素”，作用在睾丸的生精小管，促进精子发生和精子成熟。 如果FSH不足或者功能缺陷，成年后睾丸体积小，精子生成不足甚至无精子。而LH在男性中还是叫黄体生成素，但又称为“间质细胞刺激素”（ICSH），作用于睾丸的间质细胞，生成雄激素。尽管FSH和LH在两性中都发挥作用，但它们在性别上的区分是基于它们在不同性别中的具体作用和影响，而不是基于激素本身的化学结构。通过观察它们在不同性别中的作用和生理变化，可以更好地理解这些激素在生殖健康和生殖系统疾病中的重要性）。它们是控制孕酮、雄激素和雌激素等类固醇激素合成的上游激素。在PCOS模型中，无论是腹腔给药还是口服给药，ATM对FSH和LH都没有影响（图S3，A至F），这意味着促性腺激素的生成可能不受ATM的影响。因此，研究人员假设青蒿素类药物通过靶向卵巢来调节睾酮水平。为了评估这一点，研究人员将卵泡膜细胞分离出来后，检测了上清液中的类固醇激素，卵泡膜细胞是多囊卵巢综合症女性体内过量睾酮生物合成的主要来源（图3A）。ATM 以剂量依赖的方式显著抑制了子宫内膜细胞中睾酮的产生（图3B）。同样的，青蒿素类似物SM934对睾酮水平的抑制作用与 ATM 诱导的作用相当（图3C）。除了降低睾酮外，ATM和SM934还明显减少了孕烯醇酮、孕酮和 17α-OHP，它们都是卵巢类固醇生成的中间产物和睾酮的前体（图 3，D至I）。研究人员用另一种青蒿素衍生物青蒿琥酯（ATS）进一步验证了这一结果，它同样对孕烯醇酮、孕酮和17α-OHP具有剂量依赖性抑制作用（图S4，A至C）。此外，这种抑制作用不是由于细胞毒性引起的，因为青蒿素类药物不会损害子宫内膜细胞的活力（图 S5，A和B）。这些数据有力地表明，青蒿素抑制了卵泡膜细胞的类固醇生成过程和随后的雄激素合成。

脂肪组织显著表达醛酮还原酶家族1成员C3（AKR1C3），可将雄烯二酮（A4）转化为睾酮。在PCOS或肥胖症等情况下，皮下脂肪中AKR1C3的升高（可能由胰岛素增加诱导）（小编注：胰岛素可以激活NRF2，NRF2是AKR1C3的转录因子，胰岛素通过NRF2的上调来增加AKR1C3的水平）使脂肪组织成为合成雄激素的重要场所。然而，无论是在基础状态还是在胰岛素或 A4 处理下，ATM 都不会影响大鼠脂肪细胞中睾酮的产生（图 S5C）。同样，ATM 对人类脂肪细胞的睾酮生成也没有影响（图 S5D）。同样，大鼠脂肪组织中的睾酮浓度在 ATM 处理后保持不变（图 S5E）。

脂肪与雄激素

在多囊卵巢综合征（PCOS）或肥胖症等情况下，脂肪组织可以成为合成雄激素的重要场所。雄激素合成的前体主要是胆固醇。胆固醇可以在体内通过多种途径转化为雄激素，包括转化为孕烯醇酮，再进一步转化为雄烯二酮（Androstenedione, A4），最终转化为睾酮（Testosterone）。而胆固醇可以在体内多个部位合成，包括肝脏、肾上腺和卵巢。在肥胖或PCOS患者中，脂肪组织也可以成为胆固醇的来源之一。在肥胖和PCOS患者中，胰岛素抵抗导致身体为了补偿抵抗而分泌更多的胰岛素，进而导致高胰岛素血症。高水平的胰岛素可以刺激卵巢和肾上腺的莱迪希细胞分泌雄激素，并且通过其自身的受体直接刺激卵泡膜细胞产生雄激素。此外，在肥胖或PCOS情况下，某些关键酶的活性可能增加，促进雄激素的合成。例如，17β-羟类固醇脱氢酶（17β-HSD）和醛酮还原酶家族1成员C3（AKR1C3）在PCOS患者中表达上调，参与雄激素的合成。而且肥胖和PCOS常伴随慢性低度炎症，这种炎症环境可能改变脂肪组织的代谢特性，包括促进雄激素的合成。另外脂肪组织分泌的脂肪因子，如瘦素（leptin）、脂联素（adiponectin）、抵抗素（resistin）等，可能影响雄激素的合成。例如，瘦素可以抑制胰岛素诱导的卵巢类固醇生成，并抑制LH刺激的雌二醇产生。

合成雄激素的路径在肥胖或PCOS患者中与正常情况下是相似的，都是从胆固醇开始，转化为孕烯醇酮，再转化为雄烯二酮，最终转化为睾酮。但在肥胖或PCOS患者中，由于上述因素的变化，这一合成过程可能更加活跃。在PCOS中，胰岛素诱导的AKR1C3（一种参与雄激素合成的关键酶）在脂肪细胞中的表达增加，导致脂肪组织中雄激素合成的增加。而在没有肥胖或PCOS的个体中，脂肪组织合成雄激素的酶可能表达较低，胰岛素和其他激素的水平可能不足以诱导这些酶的上调，因此，脂肪组织合成雄激素的能力有限。

脂肪组织合成的雄激素通过扩散的方式进入血液循环。由于脂肪细胞周围的微环境较为宽松，新合成的雄激素可以自由地从脂肪细胞中释放出来，进入血液。脂肪组织合成的雄激素进入血液循环后，其生物学作用与通过常规途径（如肾上腺或卵巢）合成的雄激素相似。它们可以被运输到靶器官，与雄激素受体结合，发挥其生物学效应。不过，由于脂肪组织合成的雄激素可能在局部微环境中浓度较高，它们还可能对邻近的细胞和组织产生旁分泌或自分泌的影响。例如，脂肪组织合成的雄激素可能在局部产生作用，影响脂肪细胞的分化、增殖和炎症反应等，AKR1C3酶不仅在雄激素合成中起催化作用，还可能通过稳定雄激素受体（AR）来促进脂肪细胞增殖。在PCOS脂肪细胞模型中，胰岛素诱导的AKR1C3通过稳定AR来促进FASN的表达，导致脂肪细胞的增殖和脂质积累。另外，雄激素可能通过多种机制影响炎症细胞因子的表达和活性。例如，它们可能直接或间接影响巨噬细胞和其他免疫细胞的功能，从而调节这些细胞因子的产生。在肥胖和PCOS中，雄激素水平的变化可能导致促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素6（IL6）和白细胞介素1β（IL1β）的表达增加。而升高的雄激素水平可能通过增强M1型巨噬细胞的活性和/或抑制M2型巨噬细胞的功能来促进炎症状态。同时，它们也可以通过血液循环影响全身的代谢和内分泌平衡。

在PCOS或肥胖患者中，脂肪组织合成的雄激素过多可能导致或加剧激素失衡，如增加雄激素水平，这可能进一步影响胰岛素抵抗、性激素平衡和生殖健康。如文中提到的，醛酮还原酶家族1成员C3（AKR1C3）可以将雄烯二酮转化为睾酮。在PCOS或肥胖症情况下，皮下脂肪中AKR1C3的表达增加，可能由胰岛素水平的升高诱导。胰岛素可以激活NRF2（一种转录因子），进而上调AKR1C3的水平。

参考文献

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图 3| 青蒿素类药物通过下调 CYP11A1 抑制卵巢类固醇的生成和睾酮的产生

图 S3| ATM对血清LH和FSH水平没有影响

图 S4| ATS抑制卵巢类固醇激素的产生

图 S5| 青蒿素对卵巢间质细胞活力影响不大，不影响脂肪细胞中的雄激素合成

3 青蒿素通过降低CYP11A1限制睾酮的产生

为了揭示青蒿素诱导雄激素合成减少的细胞通路，研究人员分离出了用ATM处理的卵泡膜细胞，并进行了基于质谱的相对定量蛋白质组学分析。CYP11A1是受 ATM 诱导下调最显著的蛋白质（图 3J）。CYP11A1催化胆固醇向孕烯醇酮的转化，而孕烯醇酮是类固醇激素生物合成的第一步。CYP11A1催化胆固醇向孕烯醇酮的转化，而孕烯醇酮是类固醇激素生物合成的第一步。青蒿素以剂量依赖的方式抑制子宫内膜细胞孕烯醇酮的水平，而ATM下调了CYP11A1，这两个结果都证明了，青蒿素是从第一步开始抑制雄激素的合成（图3D和G）。为了验证蛋白质组学数据，研究人员检测了小鼠和大鼠卵泡膜细胞中类固醇生成酶的表达，结果发现青蒿素类药物剂量依赖性地下调了CYP11A1蛋白（图3K和图S6，A至C），而对HSD3B2和CYP17A1没有影响（图3K）。CYP11A1蛋白的下降始于ATM处理后的第8小时（图S6D）。与此相一致的是，在PCOS小鼠的卵巢中，CYP11A1蛋白在ATM 的作用下急剧下降（图 3L）。此外，青蒿素还下调了人的BeWo 绒毛膜癌细胞中的CYP11A1，这种细胞来源于人类胎盘，可以合成类固醇激素（图 S6E）。ATM 处理并未抑制类固醇生成急性调节蛋白（StAR）（图 S6F），该蛋白对于将胆固醇从线粒体外膜转运至线粒体内膜以促进类固醇激素的形成至关重要。

接下来，研究人员继续阐明CYP11A1的减少是否介导了青蒿素对睾酮合成的抑制作用。首先，研究人员给青蒿素处理的卵泡膜细胞补充孕烯醇酮，孕烯醇酮是CYP11A1催化反应的产物，会被青蒿素还原（图3A），结果表明孕烯醇酮的补充显著消除了青蒿素降低孕酮、17α-OHP和睾酮的现象（图3M）。接着，研究人员过表达CYP11A1可完全消除青蒿素处理引起的睾酮减少（图 3N）。当 CYP11A1表达被干扰时，青蒿素无法进一步减少孕酮、17α-OHP 和睾酮的产生（图 3O）。这些结果共同表明，上调和下调CYP11A1决定了睾酮的产生，青蒿素通过CYP11A1影响了睾酮的产生。

图 S6| 在分离的卵巢间质细胞和BeWo细胞中青蒿素下调CYP11A1蛋白

4 青蒿素介导LONP1和CYP11A1之间的相互作用

于是，研究人员开始探索青蒿素对CYP11A1的调控机制。虽然青蒿素类药物作为内过氧化物，通过产生活性氧（ROS）而表现出抗疟活性，但似乎 ROS 本身并没有参与 CYP11A1 的下调，因为研究人员发现ROS诱导剂伊利司莫对 CYP11A1并没有产生影响（图 S7A）。同样，ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）也不会影响ATM诱导的CYP11A1下调（图S7B）。此外，尽管青蒿素降低了CYP11A1的蛋白水平，但分离出的卵泡膜细胞（图S7，C和D）或DHEA诱导的卵巢（图S7，E和F）中Cyp11a1的mRNA水平仍不受青蒿素的影响，这表明青蒿素具有转录后调控作用。随后，研究人员检测了CYP11A1的稳定性，发现ATM和SM934明显缩短了CYP11A1蛋白的半衰期（图4A和图S8A）。进一步的研究表明，蛋白酶抑制剂 MG132 消除了ATM和SM934诱导的 CYP11A1 的蛋白水平下调（图 4B 和图 S8B），这共同表明青蒿素类药物通过抑制其蛋白的稳定性来降低 CYP11A1 的水平。

为了确定青蒿素诱导的CYP11A1不稳定性的介质，研究人员采用免疫沉淀结合质谱法（IP-MS）鉴定了在 ATM 或 SM934 处理下 与CYP11A1 相互作用的分子（图 4C）。根据 IP-MS 数据，研究人员确定了在 ATM 处理下与 CYP11A1 发生特异性相互作用的8个蛋白质，以及在 SM934 处理下与 CYP11A1 发生相互作用的23个蛋白质。在这些蛋白质中，研究人员发现有两个候选蛋白质在两组中是相同的，即长肽酶 1（lon peptidase 1，LONP1）和从 ER 到高尔基体的转运调节因子（trafficking from ER to Golgi regulator，TFG）（图 4C）。LONP1是一种 AAA+ 线粒体蛋白酶，其功能是利用ATP 水解降解折叠错误或氧化的蛋白质，这对线粒体中的蛋白质质量控制至关重要（小编注：AAA＋线粒体蛋白酶（AAA+ mitochondrial proteases）是一类具有ATPase活性的蛋白酶，属于ATPases Associated with diverse cellular Activities (AAA+) 家族。这些蛋白酶在维持线粒体功能和质量控制中扮演重要角色。AAA＋蛋白酶通过水解ATP，为蛋白酶提供能量，降解受损或不正确折叠的蛋白质）。TFG 是一种COPII囊泡相关蛋白，可调节从ER到高尔基体的转运。为了验证IP-MS的结果，研究人员进行了免疫共沉淀（co-IP）检测，发现LONP1和CYP11A1之间的相互作用在ATM和SM934诱导下显著增强，尽管青蒿素处理组中沉淀的CYP11A1甚至低于对照组，这主要是因为青蒿素处理下调了CYP11A1（图4D）。相比之下，TFG-CYP11A1之间的相互作用可通过ATM略有增强，而SM934却没有这种效果（图S9A）。随后的研究发现，过量表达LONP1会显著下调 CYP11A1（图 S9B），而TFG对其没有影响（图S9C）。这些数据共同表明，是LONP1而非TFG可能参与了CYP11A1蛋白水平的调节。内源性co-IP进一步验证了LONP1与CYP11A1之间的结合亲和力会因ATM和SM934而增强（图4E和图S9，D和E）。研究人员用纯化的LONP1和CYP11A1重组蛋白进行的下拉实验证实了这两种蛋白之间的直接结合（图S9F）。综上所述，这些数据有力地表明，青蒿素类药物增强了CYP11A1-LONP1的结合，其作用类似于“分子胶”，这是一类诱导或稳定蛋白质间相互作用的小分子。

研究人员接下来探讨了LONP1和CYP11A1中介导其相互作用的功能区域。蛋白质-蛋白质对接预测结果表明，CYP11A1中的W56至S66或F252至T259残基可能是LONP1的结合位点。因此，研究人员构建了缺失W56至S66（ΔW56-S66）或F252至T259（ΔF252-T259）的突变型 CYP11A1，发现ΔW56-S66 保留了与 LONP1 相互作用的能力，而ΔF252-T259则失去了与LONP1结合的能力（图4F），这表明CYP11A1中的F252至T259区域对于CYP11A1与LONP1的相互作用是必不可少的。为了确定 LONP1 中负责与 CYP11A1 结合的结构域，研究人员表达了LONP1的N-结构域、腺苷三磷酸酶（ATPase）结构域和蛋白水解结构域。由于LONP1是线粒体蛋白，研究人员将所有截短的结构域与LONP1的线粒体靶向序列（MTS）融合，以确保它们能导入线粒体（图4G）。意想不到的是，LONP1 的所有结构域都与CYP11A1有很强的相互作用，而没有结构域选择性（图4H）。

图 4| 青蒿素类药物增强了LONP1和CYP11A1之间的相互作用

图 S7| ATM对Cyp11a1 mRNA在卵巢间质细胞和卵巢中的表达没有影响

图 S8| 青蒿素会降低CYP11A1的稳定性

图 S9| 青蒿素增强了LONP1和CYP11A1之间的相互作用

5 LONP1促进CYP11A1降解并抑制睾酮合成

在确定青蒿素增强了CYP11A1-LONP1的相互作用之后，研究人员试图研究LONP1在青蒿素诱导的CYP11A1降解中的作用。LONP1的过表达降低了CYP11A1的水平，而蛋白酶抑制剂MG132可以扭转这一现象（图5A），也能抑制LONP1。这些结果与上述数据一致，表明MG132可以恢复青蒿素导致的 CYP11A1下降（图4B）。此外，LONP1的抑制剂CDDO-Me消除了ATM导致的CYP11A1表达减少（图5B）。用两组小干扰 RNAs（siRNAs）敲除卵泡膜细胞中的LONP1，可完全逆转ATM诱导的CYP11A1减少（图5C）。在LONP1缺失的细胞中，ATM对CYP11A1的下调几乎没有影响（图5C）。相比之下，CYP17A1仍然不受ATM和LONP1的影响（图5C）。随后，研究人员构建了无催化活性的LONP1（LONP1-S844A），其S844A（S844→A）置换破坏了负责蛋白质降解的催化二联体。LONP1-S844A不能像WT LONP1那样降低CYP11A1的表达（图5D）或缩短CYP11A1蛋白的半衰期（图5E），这表明LONP1是通过其蛋白酶活性来降低CYP11A1的。为了证实LONP1是否直接介导了CYP11A1的下调，研究人员使用纯化的CYP11A1和LONP1蛋白进行了体外蛋白酶试验。LONP1的功能需要ATP的存在。结果显示，ATM促进了LONP1催化的CYP11A1降解（图5F），而在没有LONP1或ATP的情况下，ATM对CYP11A1没有影响（图5F）。体外蛋白酶试验进一步证实，ATM和SM934都加速了LONP1催化的CYP11A1降解（图5G）。此外，不能与LONP1结合的CYP11A1突变体形式（ΔF252-T259）对青蒿素诱导的下调具有抵抗力（图S9，G和H）。这些观察结果共同支持了LONP1在介导青蒿素诱导的CYP11A1减少中不可或缺的作用。此外，研究人员还发现LONP1和CYP11A1在卵巢中都有高表达（图S9I），而且已知它们都定位于线粒体中。相似的组织分布和亚细胞定位表明，LONP1有可能在青蒿素治疗中靶向CYP11A1。

除LONP1外，研究人员还研究了线粒体基质中负责蛋白质质量控制的另一个重要蛋白酶ClpXP复合物，以确定其是否参与调控CYP11A1。ClpXP由两种不同的成分组成，一种是名为ClpX的AAA+ ATP酶，另一种是名为ClpP的肽酶。过量表达ClpP和ClpX对CYP11A1蛋白质没有影响（图S10A）。此外，眼界人员没有观察到CYP11A1与ClpP或ClpX之间的结合，青蒿素也没有促进它们之间的相互作用（图 S10B）。这些发现排除了ClpXP介导CYP11A1降解的可能性。

接下来，研究人员评估了LONP1对卵巢雄激素合成的影响。腺病毒介导的LONP1在卵泡膜细胞或BeWo细胞中的过表达下调了CYP11A1蛋白（图5H和图S11A）。由于CYP11A1的减少，LONP1过表达使卵泡膜细胞上清液中的孕烯醇酮、孕酮、17α-OHP和睾酮水平显著降低（图5，I至L）。与此相一致，在BeWo细胞中过表达LONP1也会导致类固醇生成减少（图S11，B和C）。研究人员还通过腹腔注射腺相关病毒（AAV）-LONP1在小鼠卵巢中过表达 LONP1，结果发现LONP1降低了CYP11A1（图 5M），同时抑制了血清睾酮（图 5N）。这些数据共同表明，过表达LONP1发挥了和青蒿素降低雄激素一样的作用。

GEO数据显示，与正常卵泡膜细胞相比，PCOS患者卵泡膜细胞中LONP1的表达水平显著降低（P = 0.0104）（图5O），这与LONP1对CYP11A1和雄激素合成的抑制作用相一致。研究人员进一步研究了CYP11A1-LONP1与雄激素诱导剂（如hCG）的关联。与青蒿素促进CYP11A1-LONP1相互作用的现象不同，hCG明显破坏了它们之间的相互作用（图S12A）。因此，hCG处理可促进CYP11A1水平，并逆转LONP1 过表达导致的CYP11A1降低（图S12B）。与这一结果相一致的是，通过hCG和胰岛素处理建立的PCOS小鼠模型的卵巢中CYP11A1升高（图S12C）。此外，二氢睾酮（DHT，是一种雄激素）也能恢复由LONP1引起的CYP11A1的下降（图S12D）。这些数据共同表明，雄激素诱导剂阻断了LONP1与CYP11A1之间的联系，促进了CYP11A1的表达，从而可能加剧雄激素过多。

图 5| LONP1可促进CYP11A1的降解，从而减少雄激素的合成

图 S10| ClpXP不调节CYP11A1蛋白水平

图 S11| LONP1调节BeWo细胞中的卵巢类固醇生成

图 S12| 雄激素诱导剂破坏CYP11A1-LONP1相互作用

6 LONP1是青蒿素的直接靶标

然后，研究人员试图确定青蒿素是否直接靶向LONP1或CYP11A1。为此，他们将生物素与青蒿琥酯（bio-ATS）共轭，进行下拉实验（图 6A）。研究人员证实bio-ATS能有效降低 CYP11A1的浓度（图S13A），这表明生物素附着不会影响ATS的功能。随后，研究人员进行了bio-ATS捕获试验，发现bio-ATS与LONP1蛋白具有结合亲和力，而对CYP11A1并没有这种作用（图6B和图S13B）。与游离的ATS、ATM或SM934预孵育会占据LONP1并破坏bio-ATS与LONP1之间的相互作用（图6B）。此外，化合物结合能够诱导蛋白质构像发生改变，进而影响其热稳定性。研究人员通过热稳定性检测验证了青蒿素类药物与LONP1蛋白之间的相互作用（图6C）。相比之下，ATM对CYP11A1的热稳定性没有影响（图 S13C）。这些数据共同表明，青蒿素的直接靶向LONP1，而不是CYP11A1。

为了研究青蒿素与其靶点的结合模式，研究人员对蛋白质结构进行对接计算，结果表明青蒿素衍生物与LONP1蛋白水解结构域中其抑制剂（硼替佐米，bortezomib）结合口袋进行了硅对接（图 6D）。bortezomib是一种已知的LONP1抑制剂。研究人员观察到bortezomib提高了CYP11A1的水平，并逆转了LONP1诱导的CYP11A1的下降（图S13D）。这一发现让他们推测，如果对接模拟准确的话，bortezomib可能会与青蒿素竞争与LONP1的结合。因此，研究人员进行了bio-ATS捕获试验，发现bortezomib的预孵育阻断了bio-ATS与LONP1之间的相互作用（图S13E）。与bortezomib和青蒿素竞争LONP1的结合一致，bortezomib完全消除了青蒿素导致的CYP11A1下降（图S13F）。考虑到预测的青蒿素结合口袋位于LONP1的蛋白水解结构域内，研究人员制备并纯化了该结构域，并测定了青蒿素与它的结合亲和力。表面等离子共振（SPR）显示，ATM与蛋白水解结构域的结合解离常数（KD）为 3.11 ± 0.358 μM（图 6E），SM934与蛋白水解结构域的结合亲和力（KD）为 8.69 ± 0.749 μM（图 6F），ATS与蛋白水解结构域的结合亲和力（KD）为 0.261 ± 0.029 μM（图 6G）。青蒿素类似物SM934增强了LONP1蛋白水解结构域与 CYP11A1之间的相互作用（图6H）。然后，研究人员构建了一种缺失G847至D852残基（ΔGATPKD）的LONP1突变体（小编注：这段序列直接参与了LONP1与青蒿素类药物的结合过程，当这个区域发生突变（ΔGATPKD突变体），会导致LONP1蛋白对青蒿素类药物产生抗性，也就是说，青蒿素无法再通过与突变体LONP1的结合来增强其与CYP11A1的相互作用，从而导致青蒿素无法通过突变体LONP1来增加CYP11A1的降解）。研究人员发现这些残基参与了LONP1与青蒿素的结合。与WT LONP1相似，突变体ΔGATPKD LONP1保留了与CYP11A1相互作用的能力，但它对青蒿素类药物具有抗性，青蒿素类药物未能增强ΔGATPKD LONP1与CYP11A1之间的相互作用（图6I）。为了从功能上评估LONP1的GATPKD基序对青蒿素诱导的CYP11A1降解的贡献，研究人员构建了LONP1基因敲除细胞，并用WT LONP1或突变体ΔGATPKD LONP1对其进行了回补。与对照细胞的结果相比，缺失LONP1会上调CYP11A1。用WT或突变体LONP1回补抑制了CYP11A1的升高，这表明突变体LONP1仍保留了降解CYP11A1的蛋白酶活性（图6J）。用青蒿素处理这些细胞时，对照细胞中的CYP11A1下调，而LONP1基因敲除细胞中的CYP11A1保持不变。重新引入WT LONP1恢复了青蒿素对CYP11A1 的抑制作用，而重新引入突变LONP1无法逆转青蒿素诱导的CYP11A1下调（图 6J），这可能主要是因为突变LONP1无法与青蒿素结合。值得注意的是，LONP1 中的GATPKD残基在不同物种中高度保守（图S13G），这支持了所观察到的青蒿素在啮齿动物和人类细胞中降低雄激素水平的相似效果。总之，这些数据支持了一种观点，即青蒿素类药物对CYP11A1水平的抑制作用主要依赖于其与LONP1蛋白水解结构域的结合。

图 6| LONP1是青蒿素的直接靶标

图 S13| 青蒿素直接与LONP1结合，但不与CYP11A1结合

7 双氢青蒿素对PCOS患者的治疗效果

最后，研究人员进行了一项试验性临床研究，以验证青蒿素对PCOS患者的治疗疗效。他们招募了19名符合Rotterdam多囊卵巢综合症三项诊断标准的PCOS患者，她们接受了为期12周的口服双氢青蒿素（40毫克，每天三次）治疗。所有参与者在治疗前均表现为高雄激素血症、少经或闭经以及多囊卵巢。参与者对双氢青蒿素的耐受性良好，未发现任何副作用。使用双氢青蒿素治疗可显著降低PCOS患者的血清睾酮水平（P < 0.0001）（图7A）。抗缪勒氏管激素（AMH）主要由卵巢前卵泡和小前卵泡的颗粒细胞产生。血清AMH水平与生长卵泡的数量正相关，因此在PCOS患者中通常会升高。双氢青蒿素治疗可显著降低血清 AMH（P < 0.0001）（图7B）。与这一结果相一致的是，经双氢青蒿素治疗后，超声波检查观察到前卵泡数量大幅减少（图7C）。此外，63.16%（12/19）的PCOS患者恢复了正常的月经周期（图7D和图S14）。总之，双氢青蒿素能有效改善PCOS患者的高雄激素血症，改善多囊卵巢的形态，促进月经恢复正常。

图 7| 双氢青蒿素对多囊卵巢综合征患者的治疗效果

图 S14| PCOS患者的月经周期

总结

多囊卵巢综合症（PCOS）是育龄妇女普遍存在的一种生殖障碍，其特点是雄激素过多、排卵功能障碍和多囊卵巢。尽管PCOS的发病率很高，但对其进行特异性药物干预却很困难。在这项研究中，研究人员发现青蒿素类药物是抗PCOS的药物。他们的研究结果表明，青蒿素衍生物能有效缓解啮齿类动物模型和人类患者的PCOS症状，通过抑制卵巢雄激素合成抑制高雄激素血症。青蒿素类药物能促进细胞色素P450家族11亚家族A成员1 (CYP11A1) 蛋白降解，从而阻止雄激素过度分泌。从机制上讲，青蒿素类药物直接靶向长肽酶1（LONP1），增强了LONP1-CYP11A1的相互作用，并促进了LONP1催化的CYP11A1降解。过表达LONP1复制了青蒿素降低雄激素的作用。他们的数据表明，应用青蒿素是治疗PCOS的一种有前景的方法，并强调了LONP1-CYP11A1相互作用在控制高雄激素和多囊卵巢综合征发生中的关键作用。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07185-7

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